放射治疗作为治疗头颈部恶性肿瘤的主要方法之一，在临床上取得了非常好的治疗效果，但常引起一些严重的放疗后并发症。研究^[1]表明：较高剂量的放射治疗可引起唾液腺腺泡细胞的不可逆损伤，尤其是对下颌下腺和腮腺等大唾液腺的损伤，导致唾液腺机能减退，其最主要的表现就是唾液流率减少，引起口干症(xerostomia)。目前已应用于临床的防治放射性口干症的方法主要有放疗技术的改进、下颌下腺转位和细胞保护剂、促涎剂、口腔湿润剂和人工唾液的应用及对腺体行物理或药物刺激等^[2]，但对腺体萎缩和唾液分泌功能下降的疗效并不理想。唾液腺组织工程学技术的出现，为治疗此类疾病提供了新思路。组织工程学方法是在体外培养唾液腺干细胞(salivary gland stem cell, SGSC)，将其接种在支架材料上，形成人工唾液腺并植入体内，用来代替病变的唾液腺组织，继续发挥外分泌功能。与其他已知的成体干细胞(包括骨髓间充质干细胞、脂肪来源干细胞和造血干细胞等)一样，SGSC作为未分化细胞分布于已分化的唾液腺细胞当中，具有自我更新及分化成所有特定细胞类型的能力^[3]。目前国内外已有大量研究从动物及人唾液腺中找到具有成体干细胞特征的细胞。部分研究利用药物促进SGSC增殖，探究其在放疗后唾液腺损伤中的作用。目前国外关于SGSC的分离、培养及鉴定的文献报道较多，但关于SGSC移植领域研究尚少，国内尚无相关综述报道。本文作者系统介绍了近年来国内外对SGSC的研究及其在放射性唾液腺损伤的治疗领域的最新进展。

1 SGSC研究进展 1.1 SGSC的猜想和发现

正常状态下，成熟个体组织中干细胞很少，而当组织发生损伤时，组织干细胞就会发生增殖、分化及修复受损的组织。Kwak等^[4]提出双储备干细胞理论，即唾液腺排泄管(excretory duct，ED)中的基底细胞和闰管细胞(intercalated duct，ID)或有无限增殖和定向分化潜能，可为唾液腺组织干细胞。何荣根等^[5]通过研究成年大鼠的腺管-腺泡复合体各组成细胞增殖能力发现ID或为腺泡和纹管或其他细胞的输出细胞。有研究者^[6-8]提出：凡有增殖分裂活性的腺细胞均可能成为干细胞，参与腺体的自我更新及损伤腺体的修复。Hanks等^[9]和Burford-Mason等^[10]研究发现：当唾液腺发生组织坏死或导管堵塞时具有很强的自我修复能力。临床研究^[11]显示：放射性口干症患者在停止放射治疗后的1年内唾液腺功能发生持续性的改善和恢复，而恢复程度与放射剂量相关，表明唾液腺受照后可能仍存在干细胞，并进行增殖和分化，促进唾液腺结构和功能的恢复。

Tatsuishi等^[12]首次发现：当放疗后下颌下腺组织损伤较轻时，仍可在临床样本中找到唾液腺成体干细胞(salivary gland adult stem cell，SGASC)，而接受较高放射剂量及细胞老化严重的下颌下腺组织难以培养出SGASC。

已有大量的研究^[13-18]通过建立动物腺体损伤模型在动物腺体中找到具有成体干细胞特征的细胞。Okumura等^[13]报道：将大鼠唾液腺主导管结扎后，大部分腺泡细胞消失，标记的导管细胞增生，再次松开主导管2~3周后腺体又恢复了分泌功能，说明唾液腺组织内有干细胞，能不断分化出腺泡细胞。Joraku等^[14]和Srinivasan等^[15]利用胶原及基质胶培养人SGSC, 获得具有三维立体结构(3D)的腺泡细胞及导管结构。Su等^[16]首次通过细胞片培养模型在体外获得3D人SGSC。Lombaert等^[17]首次报道小鼠SGSC体外诱导分化为腺泡细胞，且能分泌淀粉酶，体内腺体移植能够恢复部分唾液腺的形态和功能。Karbanova等^[18]研究显示：在唾液腺的腺泡和闰管中均有唾液腺前体细胞。上述研究表明：在动物和人的唾液腺组织中存在前体细胞，即SGSC。

1.2 SGSC与放射性唾液腺损伤的关系

部分研究者提出猜想：放射性唾液腺损伤的主要原因之一是较高的放射剂量使部分SGSC死亡，从而激发与之相关的信号通路^[19]，造成腺泡及导管细胞的凋亡，进而发生放射后唾液腺的不可逆性损伤, 因此放疗后唾液腺损伤的恢复程度与残留有活力的SGSC数目有关。

Lombaert等^[20]为验证这一猜想，利用角质细胞生长因子(ΔN23-KGF)诱导干细胞增殖，结果显示：无论是放射前还是放射后或放射前后使用ΔN23-KGF，SGSC均明显增多，存活的腺泡细胞数大量增加，唾液腺功能得到明显改善，这可能是因为SGSC的扩增，使得唾液腺组织得以修复，腺泡细胞得到补充，改善了唾液腺功能。

1.3 SGSC的分布

目前研究^[21]表明：SGSC可能主要位于唾液腺的闰管和ED。Man等^[22]通过向小鼠体内注射氚化胸腺嘧啶(tritiated thymidine)，1个月后观察到小鼠各种腺体细胞的增殖，其中ID增殖能力最强，且增殖的ID逐渐分化为腺泡细胞和纹管细胞，但未见其向排泄管细胞分化，结果说明闰管和ED中可能均存在SGSC，并均参与唾液腺的自我更新。Kwak等^[23]首次在研究中证实了SGSC参与维持唾液腺稳态，同时发现唾液腺闰管中存在少量K14 +-SMA^－细胞，通过遗传谱系示踪发现这些细胞不断进行自我复制，且在唾液腺发育过程中参与导管的形成和更新。

Konings等^[24]和van Luijk等^[25]研究大鼠腮腺组织对放射的敏感性发现：腮腺放射后损伤程度存在区域差异，表现为腮腺头部组织较尾部组织经放射后引起腮腺损伤更严重，提示大鼠腮腺头部组织含有更多的干细胞。van Luijk等^[25]还发现：排泄管作为唾液腺中对放射最敏感的部位可能是SGSC的来源。上述研究表明：SGASC在唾液腺中的分布是不均匀的，且主要集中于唾液腺较大的ED上。提示在放疗中保护好唾液腺较大的ED，即可能使SGASC得到较好的保护，有可能使放疗后损伤的唾液腺组织和功能得到修复。

2 SGSC的分类 2.1 下颌下腺干细胞

目前关于下颌下腺干细胞的研究较多。Okumura等^[13]首次通过结扎动物下颌下腺主导管，分离、培养其中的上皮样细胞，并标记出表达α6β1整合素(α6β1 integrin)和层黏连蛋白(laminin，LN)的上皮样细胞，将其命名为SGP-1(salivary gland progenitor-1) 细胞，这些细胞具有组织干细胞的功能，并能向内胚层细胞系分化。Kishi等^[26]首次证明了在新生和成熟小鼠下颌下腺腺管细胞中均存在自我更新和多潜能唾液腺干/祖细胞，且发现成体下颌下腺干细胞增殖潜力弱于新生小鼠，成功制备出利用单个细胞形成克隆增殖的培养体系。

Lombaert等^[17]使用悬浮球体培养系统成功分离培养了小鼠下颌下腺来源的干细胞，并证实该干细胞来源于导管上皮；体外实验表明该细胞具有向唾液腺导管细胞和腺泡细胞分化的能力；体内实验证明干细胞移植后的腺体恢复了部分分泌功能。

王春宇等^[27]从流产胎儿下颌下腺组织中分离、单克隆培养获得人唾液腺干/祖细胞，表达上皮标志CK19和LN，高表达CD90.1、CD29和CD117，体外培养也表现出高增殖能力、高克隆形成能力和较高的传代数等组织干细胞特性，提示人胎儿下颌下腺能分离出具有组织干细胞特性的细胞。

Baek等^[28]研究发现：从未行下颌下腺导管结扎大鼠的正常腺体中分离培养得到的SGSC高表达α6β1和c-kit，在12个月内传代92次仍保持细胞形态、增殖能力及多向分化潜能。此外，这些SGSC能向内胚层系细胞分化，形成腺泡样细胞及胰岛素分泌细胞。该研究证实了正常大鼠腺体中也存在SGSC，且这些细胞可以作为治疗唾液腺损伤或糖尿病的种子细胞。

2.2 腮腺干细胞

近年来关于腮腺干细胞的研究较少。Rotter等^[29]首次从人腮腺中分离和鉴定出人类腮腺干细胞。Katsumata等^[30]通过向大鼠反复注射异丙肾上腺素(IPR，一种β肾上腺素拮抗剂)来促进腮腺组织细胞的增生，并用Ki-67对细胞进行免疫组织化学标记来实现细胞增殖的量化，结果显示：注射IPR后的大鼠腮腺腺泡细胞和纹管细胞均有增殖，但不包括小叶间导管细胞，腺泡细胞的总量在注射IPR后的第5天增长了60%，而纹管细胞和小叶间导管细胞数目无明显变化。因此研究者认为：增殖的纹管细胞极有可能分化成了腺泡细胞。

2.3 小唾液腺(minor salivary glands, MSGs)干细胞

MSGs作为与大唾液腺同源的组织，从理论上讲也应含有SGSC，而目前国内外关于MSGsSGSC的研究报道较少。MSGs具有来源丰富、取材容易和创伤微小和供区隐蔽的优点。从MSGs中分离培养SGSC可为干细胞治疗和组织工程提供新的种子细胞来源。

Andreadis等^[31]首次从干燥综合征患者下唇获得MSGs，光镜下观察MSGs结构正常。体外分离培养MSGs组织获得成纤维样细胞和上皮样细胞混合细胞群，该细胞在组织特异性培养基中具有向脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞分化的潜能，并且表达早期干细胞标记物，包括Nanog、Oct-3/4和SSEA-3；此外还表达特征性间充质干细胞标记物，即CD90-Thy1、CD105、CD49f、CD81、Nestin、CD146和Stro-1。研究者^[31]还发现：细胞群中的部分细胞表达角蛋白7/8，提示其具有上皮细胞表型；但不同时表达水通道蛋白1，提示该细胞群是以间充质干细胞为主，并含少量上皮干细胞。

2.4 唾液腺间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)

MSCs是一种多潜能成体干细胞，目前已从成人的多种间充质组织中分离得到，这些细胞可以在体外进行培养增殖并分化为骨、软骨和骨髓基质等多种结缔组织细胞及骨骼肌细胞、神经细胞等。不论是自体的还是同种异体的MSCs，一般都不会引起宿主的免疫反应，因此MSCs可以作为组织工程的种子细胞，用于干细胞移植治疗。

Rotter等^[29]首次从人腮腺中分离和鉴定出人类腮腺干细胞，利用组织特异性培养基能够被诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞等间充质细胞；流式细胞术分析发现：所培养的细胞与MSCs的表面标记物表达谱具有极高相似度，且可维持传代20次。此外，这些腮腺MSCs具有多向分化潜能。

Lu等^[32]通过组织块培养法从人MSGs中分离出具有自我更新和分化能力的细胞，并发现该细胞与胚胎干细胞(ESCs)和MSCs具有相似的表型，因此认为这些细胞即人小唾液腺MSCs(human minor salivary gland mesenchymal stem cells，hMSGMSCs)。利用组织特异性培养基可以诱导该干细胞向中胚层、外胚层和内胚层分化。此外，将体外培养所得的hMSGMSCs移植到行肝脏部分切除术后的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内，hMSGMSCs可存活且迁移，并表达干细胞标志物AFP和KRT18。这些证据证实了hMSGMSCs的存在及其在干细胞治疗和再生医学中的潜能。

3 SGSC移植在放射性唾液腺损伤中的应用

在放疗过程中尽可能保护SGSC及放疗前预防性扩充SGSC是针对放射性唾液腺损伤的有效的防护措施，但受限于目前的放射治疗水平及相关研究的不完善性，其作用有限；此外，对于晚期肿瘤患者和年老患者，由于肿瘤体积较大或细胞老化严重，此类患者的SGSC大多数已发生不可逆性损伤，利用上述方法进行防护作用有限，其临床上唾液腺组织的修复十分困难。而SGSC组织工程的研究则为放射性唾液腺损伤提供了新思路。近年来已有很多研究者在进行SGSC移植的相关治疗。

Lombaert等^[17]提取小鼠下颌下腺c-Kit⁺干细胞，将其注入放射损伤后的下颌下腺，90d后注射部位形成管腔结构，且细胞移植后的腺体镜下形态与正常腺体相同，包含大量腺泡细胞；毛果云香碱刺激实验分析腺体唾液分泌功能表明：干细胞移植后的腺体恢复了23% ~ 70%的分泌功能。该研究首次证明了应用SGASC移植技术修复放射性唾液腺损伤的可行性。Nanduri等^[33]向放射损伤后的大鼠下颌下腺内分别注入表达c-Kit、CD133、CD49f和CD24等干细胞标记的细胞发现：大鼠唾液量均有提高，其中以注入c-Kit⁺细胞和CD133⁺细胞的大鼠唾液量增加较明显。Nanduri等^[34]通过将c-Kit⁺细胞联合CD24和(或)CD49标记阳性的干细胞注入放射损伤后的大鼠下颌下腺内进一步验证了干细胞移植对损伤后腺体的修复作用。

Mishima等^[35]从正常大鼠唾液腺中分离获得侧群(side population，SP)细胞未经培养将其移植到经放射后的损伤的大鼠唾液腺中发现：损伤的唾液腺功能在2个月内得到恢复，但恢复的唾液腺经镜下观察未在移植部位发现腺泡和导管样结构。该研究证实了SGSC的体外培养和标记蛋白应用对于增强放射性唾液腺损伤的功能恢复的重要性。Palmon等^[36]利用免疫磁珠细胞分选技术(magnetic affinity sorting，MASC)分离啮齿动物唾液腺来源细胞发现：通过该方法分离所得SGSC存活率高。Neumann等^[37]利用低温储藏技术储藏大鼠SGSC，3年后取出发现其依然保持稳定的特性及功能，这为SGSC自体移植提供了可能。

Jeong等^[38]和Pringle等^[39]从人下颌下腺中培养出人下颌下腺干细胞(hSGSCs)，并移植到放射性损伤的大鼠唾液腺中发现：该干细胞能够分化出腺泡和导管结构，修复损伤的唾液腺功能并恢复唾液腺形态。Yi等^[40]从人腮腺内分泌管中培养出同时具有上皮和间充质干细胞表面标志物(LGR⁺CD90⁺)的SGSC，其多能性在放射性损伤的大鼠唾液腺中得到证明。

Maimets等^[41]为了研究SGSC功能与供体年龄的相关性，分别从幼年(8 ~ 12周)和老年大鼠(22 ~ 26个月)中分离培养并经流式细胞分析(FACS)获得CD24⁺CD29⁺SGSC，通过体外培养发现：虽然老年组大鼠原代干细胞形成细胞集落的能力低于幼年组大鼠，但2组经细胞传代后扩增能力无明显差异，表明人SGSC的干性可能与年龄无明显相关性，该研究为老年人自体SGSC移植提供了可能。

4 展望

通过SGSC移植修复已受损的唾液腺，是一种有效缓解放射性口干症和提高患者生活质量的有效方法。虽然目前国外已有大量关于大鼠SGSC自体移植的研究，并有部分将人SGSC移植入大鼠放射后损伤的唾液腺体内并部分恢复其功能的相关研究，但该技术目前仍停留在动物实验阶段^[42]。目前国内在SGSC领域研究尚少，如何高效地分离和获取SGSC，如何选择和联合应用不同的干细胞表面标志物对其进行分选以获得增殖、分化潜能较强的SGSC，是目前亟待研究的问题。而获取SGSC后的培养和储存、保持其生物学活性，SGSC移植后如何保证其增殖与分化，以及在组织工程学领域和SGSC支架材料的选择及应用等领域，均有良好的研究前景。