吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (04): 845-848

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孙茂蕾, 徐晓薇, 顾中一, 刘杰, 高雪彬, 孟许亚, 孙宏晨
纳米载体逃逸溶酶体机制及其调控的研究进展
Research progress in mechanisms of lysosome escaped by nanocarriers and its regulation
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(04): 845-848
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(04): 845-848
10.13481/j.1671-587x.20170435

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收稿日期: 2016-11-08
纳米载体逃逸溶酶体机制及其调控的研究进展
孙茂蕾1 , 徐晓薇2 , 顾中一2 , 刘杰1 , 高雪彬1 , 孟许亚1 , 孙宏晨1     
1. 吉林大学口腔医院病理科, 吉林 长春 130021;
2. 吉林大学口腔医院牙周病科, 吉林 长春 130021
[摘要]: 纳米载体传递药物或核酸进入细胞,要穿透细胞膜,逃逸溶酶体并进入细胞核,其中逃逸溶酶体是纳米载体发挥作用的关键步骤。近年来,国内外许多学者根据纳米载体逃逸溶酶体的机制,利用大分子对现有纳米载体进行修饰或合成新型纳米载体。本文作者就纳米载体进入细胞的屏障、逃逸溶酶体机制及根据逃逸机制对其进行修饰调控3个方面做进行分析和综述。
关键词: 纳米载体    细胞屏障    逃逸溶酶体    修饰调控    
Research progress in mechanisms of lysosome escaped by nanocarriers and its regulation

载体能够有效地传递药物或核酸到达靶细胞,其在很大程度上提高了疾病治疗的成功率,其中纳米载体是一种纳米级微观范畴的药物或核酸控释体系,具有许多优点,例如能够克服难以穿过的生物屏障、提高生物相容性和延长循环时间等。而纳米载体的转运效率很大程度上取决于其逃逸溶酶体(lysosome)的能力,即纳米载体进入细胞后,经膜泡包被并传递进入溶酶体,成功逃离至细胞质,保护其负载物避免被溶酶体内的多种消化酶降解。全面认识纳米载体逃逸溶酶体的机制,对于提高纳米载体的转运效率具有重要的指导意义。目前我国关于具有逃逸溶酶体功能的纳米载体已有相关研究,但尚无关于其逃逸机制的综述类报道。

1 纳米载体进入细胞的屏障

不同的纳米载体可被不同的细胞屏障限制。纳米载体到达靶细胞,必须穿过细胞膜,逃逸溶酶体;负载基因的纳米载体若要实现基因的有效释放,必须在运输至细胞核的过程中穿过致密的细胞骨架,并突破核膜[1]。因此,为提高纳米载体的有效性,需要了解3个细胞屏障:细胞膜屏障、溶酶体屏障和细胞核屏障。

1.1 穿透细胞膜

细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障,药物或核酸的有效传递一定程度上取决于纳米载体进入细胞的能力。纳米载体穿过细胞膜主要受其表面蛋白多糖的影响,蛋白多糖介导的非特异性静电结合引发传递小泡内吞,使纳米载体进入细胞。除此因素外,纳米载体大小也影响入胞效率,其与细胞膜接触面积较多时有更高的摄取率,但是这种影响不适用于受体介导的跨膜转运。由于受体-配体结合可以实现药物或核酸的靶向传递,减小对正常组织的毒副作用,因此目前很多研究集中于受体-配体结合的纳米载体体系,以促进其经网格蛋白介导的内吞作用向靶细胞传递药物或核酸[2]

1.2 逃逸溶酶体

胞内体(endosome)是动物细胞内的膜性细胞器,传输由内吞作用摄入的物质到达溶酶体。纳米载体被膜泡包被进入细胞后,经过脱包被作用与第一胞内体融合。胞内体上有ATP驱动的质子泵,将氢离子泵入胞内体腔内,使腔内pH由约6.2降低至约5.5[3],促使第一胞内体成熟,形成第二胞内体。第二胞内体与包含特定消化酶的溶酶体融合,纳米载体与消化酶作用,导致负载药物或核酸被降解。因此纳米载体能否逃逸溶酶体对其负载物的传递至关重要。

1.3 进入细胞核

细胞骨架物质作为分子筛可以防止大分子扩散。病毒在细胞质内通过微管介导移动,然而传递基因的纳米载体从溶酶体释放进入细胞质后,缺乏这类协助作用,因此可在纳米载体上修饰核定位序列以促进入核。在细胞分裂过程中,基因在核膜消失时进入细胞核;在细胞静止状态下,基因通过细胞核膜上的核孔复合体被动扩散穿过核膜,实现基因转染[2, 4]

以上3种细胞屏障中,逃逸溶酶体是纳米载体有效转运药物或核酸的最大挑战。目前许多载体设计着眼于大分子成分如何从溶酶体释放出来进入到细胞质中。因此,探讨纳米载体逃逸溶酶体的机制并进行调控尤为重要。

2 逃逸溶酶体的机制

大多数纳米载体通过内吞途径进入细胞,随着胞内体酸化成熟并传递进入溶酶体,所载药物或基因被消化酶破坏。因此,设计出具有逃逸溶酶体功能的纳米载体,首先要深入研究其逃逸溶酶体的机制。目前,普遍认为纳米载体通过以下5种机制逃逸溶酶体。

2.1 质子海绵效应

具有较高缓冲能力和适应性的物质进入胞内体后,为缓冲胞内体内酸性环境,大量吸收质子,造成跨膜电压的不同,为达到电荷平衡和浓度平衡,细胞质中的氯离子和水大量内流[5-6],最终胞内体溶涨破裂,内容物释放到细胞质中,即质子海绵效应。在酸性环境中,包含低解离常数(pKa)胺基的大分子具有质子海绵效应,例如聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)及其衍生物,由这类成分与核酸形成的复合体被细胞内吞后,能够在胞内体小泡中发挥缓冲能力,导致胞内体膨胀破裂,将核酸释放到细胞质中[7]

2.2 降低溶酶体膜的稳定性 2.2.1 膜融合

包膜病毒具有膜融合肽,pH降低时通过改变其形状与靶向膜融合,可以高效逃逸溶酶体。例如,血细胞凝集素是流感病毒外膜的多肽,能帮助病毒破坏溶酶体并进入细胞质[8]。当环境由中性变为酸性时,血细胞凝集素从亲水性环状转变为疏水性螺旋形[9],暴露出融合肽,后者插入靶向膜中;经过一系列蛋白构型变化,插入靶向膜的融合肽与病毒膜的跨膜域被拉近,2个融合膜的外层小叶合并,导致半融合。随后跨膜域-融合肽复合体形成,融合肽进入内部小叶,进一步扰乱膜稳定性,最终膜融合。因此,在纳米载体表面覆盖膜结构,可以通过膜融合方式逃逸溶酶体[10]

2.2.2 孔洞形成

孔洞形成是细菌外毒素介导的逃逸溶酶体的基本方法[11]。此类多肽可溶于水,在pH为7时呈无规则线圈结构;随pH下降,多肽中某些氨基酸质子化形成与胞内体膜有较高亲和力的两亲性α-螺旋,黏附或插入到胞内体膜中形成孔洞。孔洞有2种形式:多肽垂直于膜平面形成木桶式孔洞;多肽垂直插入膜中使膜向内弯曲形成环孔式孔洞。随后多肽结合到孔洞边缘,向内的膜张力释放,孔洞关闭[12]

2.2.3 形成中性电子对

胞内体膜外层磷脂呈阴性,阳离子纳米载体被胞内体内化后与其膜通过静电作用引起触发器机制(开关效应),胞内体膜外层的阴性磷脂翻转到胞内体腔侧,与阳离子纳米载体形成中性电子对导致胞内体非膜相结构形成,进而稳定性降低。脂质体上的正电荷暴露给胞内体膜是阳离子脂质体与阴性胞内体膜静电相互作用的先决条件[7]

2.3 光化学内化

将大分子从溶酶体内释放到细胞质中的光化学释放技术称为光化学内化[13-14]。氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体的新陈代谢过程中起重要作用,正常情况下两者处于动态平衡,一旦平衡被打破,会形成氧自由基连锁反应,损害生物膜及其功能。光化学内化技术正是利用这一特点促进大分子逃逸溶酶体。根据光敏剂性质的不同,光敏剂可以定位在胞内体膜附近或者嵌入胞内体膜中[15]。光照条件下,光敏剂激发形成单线态氧引起胞内体膜上脂质过氧化,导致胞内体膜破坏[16]。但是这些酸性细胞器的内容物仍保持完整,并且可以传递到细胞质中。

3 合成逃逸溶酶体的纳米载体物质

目前为止,研究者们根据不同的逃逸溶酶体机制,将许多物质用于合成和促进逃逸溶酶体的纳米载体,包括聚合物、蛋白质、多肽和脂类,对临床实际应用具有重要价值。

3.1 聚合物

Shahbazi等[17]合成多孔硅纳米颗粒(porous silicon nanoparticles,PSI),由PEI、聚甲基乙烯基醚马来酸共聚物[poly(methyl vinyl ether-co-maleic acid),PMVE-MA]和十一碳烯酸功能化热烃化多孔硅纳米粒子(undecylenic acid functionalized thermally hydrocarbonized porous silicon nanoparticles,UnTHCPSi)组成。PMVE-MA的羧基与UnTHCPSi-PEI表面的游离胺基结合形成氨基化合物,在中性条件下稳定,在酸性环境中迅速水解,暴露出超支化PEI的游离胺基,引起质子海绵效应。另一方面,PMVE-MA层与胞内体膜融合,也可以促进PSI逃逸溶酶体。可见,对纳米载体表面进行化学修饰有利于调整其生物功能。

Gao等[18]合成pH敏感型聚合物胶粒,由聚(2-乙基-2-恶唑啉)-聚(D, L-丙交酯)(PEOz-PLA)调控。胶粒通过内化进入溶酶体后,胶粒外壳中PEOz的叔酰胺质子化,胶粒间氢键相互作用造成胶粒外壳裂解;同时,PEOz在溶酶体pH下离子化使胶粒表面电荷密度增加,导致静电排斥增加,进一步引起胶粒裂解,使负载药物释放。体外实验[18]结果显示:胶粒内化后引起质子海绵效应并进一步破坏溶酶体膜,促进胶粒及其负载药物的释放。

氯喹和氯化铵等均具有亲脂性,能渗透进入细胞膜和囊泡膜。这些物质在酸性的溶酶体中质子化,成为质子海绵[12]。由于此类物质细胞毒性较高,较少应用于修饰纳米载体。

Yuan等[19]合成了活性氧应答型聚合体,由聚集诱导发光光敏剂(aggregation-induced emission photosensitizer,AIEPS)与低聚乙烯亚胺(oligoethylenimine,OEI)通过氨基丙烯酸(aminoacrylate,AA)连接器结合。光照下,光敏剂促进活性氧生成,破坏胞内体膜以促进载体逃逸溶酶体。与此同时活性氧破坏AA连接器导致聚合体分裂,促使高相对分子质量复合体逆转到低相对分子质量状态,从而释放DNA。单一光激发过程同时完成逃逸溶酶体和核酸的释放,这为光控基因传递体系提供了一个新的平台。光化学内化技术已经被应用于一些纳米载体的传递,具有可观前景。

3.2 蛋白质和多肽

蛋白质和多肽由于其生物可降解性和生物相容性而得到广泛关注,应用于调控纳米载体。

3.2.1 病毒衍生物

为模仿血细胞凝集素的功能,许多合成多肽用于传递核酸或药物,例如根据流感病毒变异型合成的GALA。GALA在中性pH值下呈无规则线圈状,当pH降低至5时形成α-螺旋,此构象与胞内体膜融合,导致囊泡内容物扩散到细胞质中[20]。另一种根据血细胞凝集素亚族HA-2野生型合成的KALA,具有类似功能。Wan等[21]合成多肽型载体,由多聚-L-赖氨酸树状分子(poly-L-lysine dendrons,DEN)、DNA或RNA及膜渗透性多肽TAT组成,并分别用GALA或KALA修饰,较未修饰载体比较,2种修饰均可增加逃逸溶酶体效率,并且GALA修饰载体毒性较低。

3.2.2 细菌衍生物

许多pH敏感性多肽与不同类型的聚合体结合,用于传递基因或药物。例如,李氏杆菌O为胆固醇依赖型毒素,酸性pH值致溶酶体膜孔洞形成。在一些研究中,将李氏杆菌O用作逃逸溶酶体物质,结合到脂质载体[22]或聚合体[23]上,可以有效提高基因转染效率。

Walker等[24]用霍乱毒素B亚族修饰介孔二氧化硅纳米载体,在细胞内化后通过倒退路径,从溶酶体倒退至高尔基体,进而逃逸溶酶体。

3.2.3 人或动物衍生物

Lee等[25]发现:在酸性环境下,蜂毒肽形成两亲性α-螺旋插入胞内体膜中,此构象导致膜上孔洞形成。此类多肽与脂质载体或阳离子聚合体结合,均可以修饰纳米载体以逃逸溶酶体。

Kim等[26]首次阐明了抗体逃逸溶酶体的机制。TMab4属于IgG类抗体,酸性pH使TMab4形状改变,进而与胞内体膜结合导致环形孔形成,胞内体膜稳定性降低,随后TMab4释放。TMab4的环形孔形成能力只发生在酸性胞内体中,这种pH值依赖性不会对活细胞产生毒性。因此,了解此类细胞质渗透性抗体的溶酶体逃逸机制并对其进行改进,使IgG抗体直接成为靶向细胞质蛋白,在疾病研究、诊断和治疗等方面均有较大潜力。

3.2.4 合成多肽

富含谷氨酸的酸性氨基酸序列具有依赖pH值的膜破坏行为。Ahmad等[27]选择了3种膜破坏抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP),即LL-37、蜂毒肽和Bombolitin V,并用谷氨酸替换其所有正电荷氨基酸形成衍生物,修饰一种脂质覆盖纳米粒子复合物,该衍生物具有pH值依赖的膜破坏作用。AMP具有膜渗透性,其衍生物中的谷氨酸在酸性环境下通过质子化作用,破坏胞内体膜,导致纳米粒子复合物释放到细胞质中。

Gu等[28]模仿流感病毒逃逸溶酶体的机制,合成了二嵌段聚合体(A-C3),由聚(2-二甲胺基乙基丙烯酸酯)[poly(2-dimethylaminoethylacrylate),PDMAEA]、聚丙烯酸丁酯[poly(butyl acrylate),PBA]和聚N-[3-(1-咪唑基)丙基]丙烯酰胺(PImPAA)组成。PImPAA与PBA作为A-C3的第二嵌段,与胞内体膜融合,促进该纳米载体逃逸溶酶体,使装载的siRNA释放到细胞质中。因此,用融合肽修饰纳米载体,是逃逸溶酶体的另一种有效方式。

3.3 脂质载体和脂质体

Gujrati等[29]合成一种阳离子脂质载体(1-氨乙基)亚氨基[N-(油酰半胱氨酰-1-氨乙基)-丙酰基] (ECO)。ECO纳米载体具有pH值敏感性,其电动电势随pH值降低而升高,内化进入溶酶体后,阳离子端基中的胺基质子化,破坏胞内体膜,进而逃逸溶酶体。

Li等[30]利用二硬脂酰磷酸乙醇胺-聚羧酸甜菜碱(polycarboxybetaine based distearoylphosphoethanolamine-polycarboxybetaine,DSPE-PCB)修饰阳离子脂质体。DSPE-PCB属于两性离子,呈电中性,能够覆盖阳离子脂质体表面电荷,在生理条件下抵制非特异性蛋白吸附;在酸性环境中PCB表面羧基质子化,导致其脂质体表面正电基团相对增多,促进脂质体与阴离子磷脂膜形成离子对,进而降低溶酶体膜稳定性,最终导致siRNA释放进入细胞质中。

4 前景与展望

纳米载体能够有效地保护药物或核酸到达靶细胞,但经内吞作用进入细胞后,被胞内体摄取最终传递到溶酶体中仍然是其有效生物传递的主要障碍。因此,根据逃逸溶酶体机制合成或修饰纳米载体,可以进一步提高生物利用率。目前具备逃逸溶酶体功能的纳米载体的研究还停留在体外阶段,因此纳米载体的体内应用对于研究人员来说仍然具有挑战性。

参考文献
[1] Gottfried LF, Dean DA.Extracellular and intracellular barriers to non-viral gene transfer[A]. Wei M, Good D.Novel gene therapy approaches[M]. Croatia:INTECH, 2013:75-88.
[2] Mintzer MA, Simanek EE. Nonviral vectors for gene delivery[J]. Chem Rev, 2009, 109(2): 259–302. DOI:10.1021/cr800409e
[3] Scott CC, Vacca F, Gruenberg J. Endosome maturation, transport and functions[J]. Semin Cell Dev Biol, 2014, 31: 2–10. DOI:10.1016/j.semcdb.2014.03.034
[4] Jones CH, Chen CK, Ravikrishnan A, et al. Overcoming nonviral gene delivery barriers:perspective and future[J]. Mol Pharm, 2013, 10(11): 4082–4098. DOI:10.1021/mp400467x
[5] Mindell JA. Lysosomal acidification mechanisms[J]. Annu Rev Physiol, 2012, 74: 69–86. DOI:10.1146/annurev-physiol-012110-142317
[6] Graves AR, Curran PK, Smith CL, et al. The Cl-/H+ antiporter ClC-7 is the primary chloride permeation pathway in lysosomes[J]. Nature, 2008, 453(7196): 788–792. DOI:10.1038/nature06907
[7] Guo S, Huang L. Nanoparticles escaping RES and endosome:challenges for siRNA delivery for cancer therapy[J]. J Nanomater, 2011, 2011: 11.
[8] Ferrer-Miralles N, Vázquez E, Villaverde A. Membrane-active peptides for non-viral gene therapy:making the safest easier[J]. Trends Biotechnol, 2008, 26(5): 267–275. DOI:10.1016/j.tibtech.2008.02.003
[9] Martens TF, Remaut K, Demeester J, et al. Intracellular delivery of nanomaterials:how to catch endosomal escape in the act[J]. Nano Today, 2014, 9(3): 344–364. DOI:10.1016/j.nantod.2014.04.011
[10] Chang DK, Cheng SF, Kantchev EA, et al. Membrane interaction and structure of the transmembrane domain of influenza hemagglutinin and its fusion peptide complex[J]. BMC Biol, 2008, 6(1): 2. DOI:10.1186/1741-7007-6-2
[11] Mandal M, Lee KD. Listeriolysin O-liposome-mediated cytosolic delivery of macromolecule antigen in vivo:enhancement of antigen-specific cytotoxic T lymphocyte frequency, activity, and tumor protection[J]. Biochim Biophys Acta, 2002, 1563(1/2): 7–17.
[12] Varkouhi AK, Scholte M, Storm G, et al. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals[J]. J Control Release, 2011, 151(3): 220–228. DOI:10.1016/j.jconrel.2010.11.004
[13] Selbo PK, Weyergang A, Høgset A, et al. Photochemical internalization provides time-and space-controlled endolysosomal escape of therapeutic molecules[J]. J Control Release, 2010, 148(1): 2–12. DOI:10.1016/j.jconrel.2010.06.008
[14] De Bruin KG, Fella C, Ogris M, et al. Dynamics of photoinducedendosomal release of polyplexes[J]. J Control Release, 2008, 130(2): 175–182. DOI:10.1016/j.jconrel.2008.06.001
[15] Ohtsuki T, Miki S, Kobayashi S, et al. The molecular mechanism of photochemical internalization of cell penetrating peptide-cargo-photosensitizer conjugates[J]. Sci Rep, 2015, 5: 18577.
[16] Selbo PK, Bostad M, Olsen CE, et al. Photochemical internalisation, a minimally invasive strategy for light-controlled endosomal escape of cancer stem cell-targeting therapeutics[J]. Photoch Photobiol Sci, 2015, 14(8): 1433–1450. DOI:10.1039/C5PP00027K
[17] Shahbazi MA, Almeida PV, Mäkilä EM, et al. Augmented cellular trafficking and endosomal escape of porous silicon nanoparticles via zwitterionic bilayer polymer surface engineering[J]. Biomaterials, 2014, 35(26): 7488–7500. DOI:10.1016/j.biomaterials.2014.05.020
[18] Gao Y, Li Y, Li Y, et al. PSMA-mediated endosome escape-accelerating polymeric micelles for targeted therapy of prostate cancer and the real time tracing of their intracellular trafficking[J]. Nanoscale, 2015, 7(2): 597–612. DOI:10.1039/C4NR05738D
[19] Yuan Y, Zhang CJ, Liu B. A Photoactivatable AIE Polymer for Light-controlled gene delivery:concurrent endo/lysosomal escape and DNA unpacking[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2015, 54(39): 11419–11423. DOI:10.1002/anie.201503640
[20] Li W, Nicol F, Szoka FC Jr. GALA:a designed synthetic pH-responsive amphipathic peptide with applications in drug and gene delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2004, 56(7): 967–985. DOI:10.1016/j.addr.2003.10.041
[21] Wan Y, Moyle PM, Christie MP, et al. Nanosized, peptide-based multicomponent DNA delivery systems:optimization of endosome escape activity[J]. Nanomedicine, 2016, 11(8): 907–919. DOI:10.2217/nnm.16.27
[22] Kullberg M, Owens JL, Mann K. Listeriolysin O enhances cytoplasmic delivery by Her-2 targeting liposomes[J]. J Drug Target, 2010, 18(4): 313–320. DOI:10.3109/10611861003663549
[23] Kim NH, Provoda C, Lee KD. Design and characterization of novel recombinant listeriolysin o-protamine fusion proteins for enhanced gene delivery[J]. Mol Pharm, 2015, 12(2): 342–350. DOI:10.1021/mp5004543
[24] Walker WA, Tarannum M, Vivero-Escoto JL. Cellular endocytosis and trafficking of cholera toxin B-modified mesoporous silica nanoparticles[J]. J Mater Chem B, 2016, 4(7): 1254–1262. DOI:10.1039/C5TB02079D
[25] Lee MT, Sun TL, Hung WC, et al. Process of inducing pores in membranes by melittin[J]. Pro Natl Acad Sci USA, 2013, 110(35): 14243–14248. DOI:10.1073/pnas.1307010110
[26] Kim JS, Choi DK, Shin JY, et al. Endosomal acidic pH-induced conformational changes of a cytosol-penetrating antibody mediate endosomal escape[J]. J Control Release, 2016, 235: 165–175. DOI:10.1016/j.jconrel.2016.05.066
[27] Ahmad A, Ranjan S, Zhang W, et al. Novel endosomolytic peptides for enhancing gene delivery in nanoparticles[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1848(2): 544–553. DOI:10.1016/j.bbamem.2014.11.008
[28] Gu W, Jia Z, Truong NP, et al. Polymer nanocarrier system for endosome escape and timed release of siRNA with complete gene silencing and cell death in cancer cells[J]. Biomacromolecules, 2013, 14(10): 3386–3389. DOI:10.1021/bm401139e
[29] Gujrati M, Malamas A, Shin T, et al. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release[J]. Mol Pharm, 2014, 11(8): 2734–2744. DOI:10.1021/mp400787s
[30] Li Y, Cheng Q, Jiang Q, et al. Enhanced endosomal/lysosomal escape by distearoylphosphoethanolamine-polycarboxybetaine lipid for systemic delivery of siRNA[J]. J Control Release, 2014, 176: 104–114. DOI:10.1016/j.jconrel.2013.12.007