白血病是一种源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，急性白血病是多发于儿童的恶性血液疾病，近年来，随着联合化疗、造血干细胞移植等针对白血病治疗方案的不断改进，儿童急性白血病的治疗效果得到了大幅度提升^[1-3]。目前，急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患儿的5年无病生存率已分别超过90%和50%，但治疗过程中的耐药和复发仍然是困扰治疗的难题^[4-5]。学术界普遍认为:在首次化疗后得到完全缓解的急性白血病患儿复发的主要原因与微小残留病等存在相关性，不少学者通过白血病细胞免疫表型检测等进行了多参数分析来实现对急性白血病疗效和预后的预测^[6]。白血病干细胞(leukemia stem cells，LSC)恶性克隆是白血病的根本病因，LSC具有无限增殖和自我更新能力并且处于静止期，能够逃脱化学药物的杀伤作用，这是引起白血病复发和难治的根源^[7]。近年来大量研究^[8]证实：LSC特异性表面抗原或分子标志物系统能够作为评价白血病耐药和复发风险的重要靶点，也成为近年来的研究热点之一。国内针对LSC的分子生物学特征与急性白血病患儿预后的研究较少，尚未见联合考查LSC表面CD96和CD71表达的专题研究。本研究针对LSC表面CD96和CD71表达对急性白血病患儿疗效及预后的影响进行了研究和分析，现报道如下。

选取2010年3月—2011年2月本院小儿肿瘤科收治的急性白血病患儿80例作为研究对象，所有纳入研究患儿均经临床体征、常规实验室检查及骨髓细胞检查、免疫分型、遗传分子生物学检查确诊为急性白血病，诊断标准参考2006年全国小儿血液病学术会议制订的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议》。排除慢性白血病、并发有心肝肾等重要器官功能不全、并发其他类型血液病和不能完成本研究随访的患儿。其中男性52例，女性28例，年龄1个月~14岁，中位年龄为7岁。ALL患儿39例，男性25例，女性14例，中位年龄为7.2岁；重度患儿12例，中度患儿15例，轻度患儿12例。AML患儿41例，男性27例，女性14例，中位年龄为6.8岁；重度患儿13例，中度患儿16例，轻度患儿12例。2组白血病患儿在年龄、性别构成和病情程度等方面比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。

纳入研究患儿的治疗方案均依据患儿的个体病情，参考全国小儿血液病学术会议于2004年制订的《小儿急性髓细胞白血病诊疗建议》及2006年制订的《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议》实施。

于患儿初诊时抽取骨髓标本，以PBS稀释后采用淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，以L-DMEM培养基重悬后接种于培养瓶，置于37℃、CO₂培养箱中培养。应用分选型流式细胞仪(美国Becman公司)在分离的单个核细胞中分选LSC^[9]。选取分选出的LSC数管，其中一管加入FITC-IgG1和PE-IgG1，作为对照管，其余管加入经荧光标记的CD96和CD71抗体(美国BD公司)，经洗涤、重悬后应用流式细胞术对LSC表面的CD96和CD71表达情况进行检测，表达细胞比例≥1%判定为阳性表达。

对所有患儿首次化疗后的疗效进行评价，疗效评定标准参照《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议》制订。① 完全缓解：经治疗，临床症状消失，生活恢复正常，外周血象中血红蛋白(Hb)水平、中性粒细胞绝对值和血小板(PLT)等指标明显恢复且血象细胞分类无白血病细胞，骨髓象原+幼稚淋巴细胞比例 < 5%。② 部分缓解：经治疗，骨髓象原+幼稚淋巴细胞比例为5%~20%，或临床症状、外周血象改善情况未达到完全缓解标准者。③ 未缓解：症状、血象、骨髓象未达到部分缓解标准者。以“完全缓解”和“部分缓解”为临床有效。对所有患儿进行为期5年的随访，随访方式为电话随访和登门随访相结合，对患儿的5年生存率及化疗后感染、化疗后复发和髓外浸润的发生率进行观察和比较。

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。患儿疗效、临床有效率、CD96及CD71阳性表达率、患儿生存率和不良预后事件发生率等计数资料以百分率表示，其中疗效分布的比较采用频数表的秩和检验(Mann-Whitney U法)，CD96及CD71阳性表达率、临床有效率、生存率和不良预后事件发生率等无等级关系计数资料比较采用χ²检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

本组80例急性白血病患儿中，38例(47.5%)患儿LSC表面CD96阳性表达，45例(56.3%)患儿LSC表面CD71阳性表达，2种抗原阳性表达率比较差异无统计学意义(χ²=1.227，P=0.268)。在2类急性白血病中，AML患儿LSC表面CD96和CD71阳性表达率均明显高于ALL患儿，差异均有统计学意义(χ²=22.225，P < 0.01;χ²=34.028，均P < 0.01)。见表 1。

LSC表面CD96阴性表达患儿首次化疗后的临床有效率和疗效分布均优于LSC表面CD96阳性表达患儿，LSC表面CD71阴性表达的患儿首次化疗后的临床有效率和疗效分布优于LSC表面CD71阳性表达患儿，组间比较差异均有统计学意义(χ²=11.323，χ²=16.589，P < 0.05；U=2.939，U=2.291，P < 0.05)。见表 2和3。

LSC表面CD96阴性表达患儿5年生存率明显高于LSC表面CD96阳性表达患儿(χ²=5.051，P < 0.05)，化疗后感染、化疗后复发和髓外浸润的发生率明显低于LSC表面CD96阳性表达患儿(χ²=8.316，χ²=13.288，χ²=5.389，P < 0.05)；LSC表面CD71阴性表达患儿化疗后感染发生率和复发率明显低于LSC表面CD71阳性表达患儿(χ²=6.622，χ²=10.787，P < 0.05)，而LSC表面CD71表达阴性患儿与LSC表面CD71阳性表达患儿5年生存率和髓外浸润发生率比较差异均无统计学意义(χ²=0.544，χ²=0.176，P > 0.05)。见表 4和5。

本研究结果显示：AML患儿LSC表面CD96和CD71的阳性表达率较高，而且CD96和CD71阳性表达患儿的首次化疗疗效较差，提示LSC表面CD96和CD71的表达与急性白血病患儿的原发耐药有关联，表明LSC表现的抗原状态可能对白血病患儿对化疗药物的敏感性产生影响。本研究结果与王毅捷等^[10]的研究结果相似，该研究结果显示：急性白血病患者外周血CD96表达水平高于健康人群，但ALL和AML患者外周血CD96表达水平比较差异无统计学意义，CD96阳性表达患者的缓解率明显低于CD96阴性表达患者，复发率明显高于CD96阴性表达患者。王学梅等^[11]针对急性白血病患儿LSC的研究也得出相似的结果，同时该研究还报道了LSC表面CD96阳性表达的急性白血病患儿多伴有预后不良的染色体核型，但不同种族患儿之间CD94阳性表达率比较差异无统计学意义。刘晔华等^[12]的研究结果显示：AML患者的CD96和CD123平均表达水平明显高于ALL患者，CD96阳性表达与CD96阴性表达患者的诱导化疗缓解率比较差异有统计学意义，提示CD96的阳性表达可能与原发耐药有关，且CD96在预测化疗疗效方面的特异性高于CD123。吴颖等^[13]针对急性白血病患者的骨髓单个核细胞(BMMNC)表面分子CD96表达情况的研究结果显示：急性B淋巴细胞性白血病(B-ALL)患者、急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)、AML患儿和健康儿童的BMMNC中CD96平均表达水平比较差异有统计学意义，经正规治疗后，CD96阳性表达与CD96阴性表达患儿的缓解率比较差异有统计学意义，而在白细胞计数、Hb水平和血小板计数等方面比较差异无统计学意义，且分子生物学及细胞遗传学特征也不明显，研究者主张可以将急性白血病BMMNC表面的CD96表达情况作为评价原发耐药或复发进展的重要指标。

本研究结果显示：LSC表面CD96阳性表达患儿的预后明显差于CD96阴性表达的患儿，而LSC表面CD71阳性表达患儿仅在化疗后感染和化疗后复发2个方面差于CD71表达阴性的患儿，体现了LSC表面CD96表达情况能够作为预测急性白血病患儿预后的重要指标，而LSC表面CD71表达情况仅与患儿化疗后骨髓抑制和复发等个别预后指标有关联，对于患儿生存率等主要预后指标的影响尚有待于进一步研究。CD71是一种参与铁吸收和调节细胞生长的Ⅱ型跨膜糖蛋白，能够表达于细胞表面并通过受体介导的内吞作用调节细胞内外铁的转运，其表达水平受细胞内铁水平的影响，主要生物功能是维持体内铁的稳定性。虽然已有针对CD96与急性白血病预后关系的报道且结论较为一致，但针对CD71与急性白血病的专题性研究较少，仅有肖平等^[14]的研究报道了CD71在AML各亚型患儿LSC表面呈现高表达；研究者^[14]认为：CD71的表达具有亚型特异性，能够用于鉴别诊断ALL和AML，但并未涉及其与预后的相关性。虽然有不少研究证实了高表达CD71的急性白血病患儿可能会出现白细胞、乳酸脱氢酶水平升高等影响预后的高危因子，但仅有少量的生存分析研究显示高表达CD71的T-ALL患儿可能出现总生存期和无病生存期缩短，且有研究^[15]得出了相悖的结论。一些研究者针对CD71与其他血液疾病的相关性进行了研究，魏园玉等^[16]研究CD71作为增殖指标在各型AML、B-ALL、T-ALL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多发性骨髓瘤(MM)等多种血液肿瘤细胞中的表达结果显示：除CLL细胞外，其余血液肿瘤细胞的CD71表达率均高于健康细胞，CD71阳性表达率与S期细胞比率、Ki-67阳性表达率均呈正相关关系。针对骨髓增生异常综合征(MDS)和再生障碍性贫血(AA)患者的骨髓血细胞CD71表达情况的研究^[17-19]结果显示：MDS患者的骨髓血细胞CD71阳性表达率明显高于AA患者，CD71阳性表达率≥15%的MDS患者外周血中血小板数明显高于AA患者。江亚军等^[20]的研究结果显示：缺铁性贫血患者红细胞CD71与其网织红细胞百分比呈正相关关系，而与其他血流指标无相关性，因此其变化程度与疾病的严重程度具有关联性。而LSC表面CD96和CD71的阳性表达率与白血病患儿耐药现象的相关性尚需要进一步的研究予以证实。

综上所述，急性白血病患儿LSC表面的CD96和CD71表达与其疾病亚型、首次化疗疗效具有一定的关联，可作为辅助诊断和评价疗效的标志物，CD96阳性表达与患者的预后具有相关性，可作为预测患者预后的指标。