吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (04): 729-733

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白静, 冀晓茹, 韩婷, 安春娜, 勾向博, 苏鹏, 王妍
BAI Jing, JI Xiaoru, HAN Ting, AN Chunna, GOU Xiangbo, SU Peng, WANG Yan
芦丁对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾组织形态表现的影响
Influence of rutin in renal tissue morphology in STZ-induced diabetes mice
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(04): 729-733
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(04): 729-733
10.13481/j.1671-587x.20170413

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收稿日期: 2016-10-26
网络出版时间: 2017-07-04 09:25:39
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白静, 冀晓茹, 韩婷, 安春娜, 勾向博, 苏鹏, 王妍. 芦丁对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾组织形态表现的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(04): 729-733.
BAI Jing, JI Xiaoru, HAN Ting, AN Chunna, GOU Xiangbo, SU Peng, WANG Yan. Influence of rutin in renal tissue morphology in STZ-induced diabetes mice[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(04): 729-733.
芦丁对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾组织形态表现的影响
白静1 , 冀晓茹1 *, 韩婷1 , 安春娜1 , 勾向博1 , 苏鹏2 , 王妍2     
1. 华北理工大学基础医学院药理系, 河北 唐山 063000;
2. 华北理工大学冀唐学院, 河北 唐山 063000
收稿日期: 2016-10-26 ; 网络出版时间: 2017-07-04 09:25:39
基金项目: 河北省科技厅自然科学基金资助课题（H2014209194）
作者简介: 白静(1978-), 女, 辽宁省葫芦岛市人, 医学硕士, 主要从事中医药防治糖尿病方面的研究。
*华北理工大学药学院药学专业2014级
[摘要]: 目的: 探讨芦丁对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠肾组织形态的影响，阐明芦丁对肾组织损害的治疗作用。方法: 雄性昆明小鼠70只，其中12只小鼠作为正常组，其余小鼠腹腔注射62.5mg·kg-1STZ，每天1次，连续5d，制备1型糖尿病模型。随机选取造模成功的48只小鼠分为模型组、低剂量芦丁组（50 mg·kg-1）、高剂量芦丁组（100 mg·kg-1）和厄贝沙坦组（45 mg·kg-1），每组12只。各组小鼠灌胃相应药物，正常组和模型组小鼠灌胃等体积的羧甲基纤维素钠溶液，每天1次，持续8周。测定各组小鼠体质量和随机血糖。全自动生化分析仪检测小鼠血肌酐（Cre）和血尿氮素（BUN）水平，计算肾指数。分别通过HE染色法、Masson染色法和电镜观察小鼠肾组织形态表现。结果: 采用小剂量连续注射STZ造模后，成模率达98%。与正常组比较，给药前各组小鼠体质量比较差异无统计学意义（P>0.05），给药后模型组，低、高剂量芦丁组和厄贝沙坦组小鼠体质量均明显下降（P < 0.05）。与模型组比较，不同剂量芦丁组小鼠血糖水平明显降低（P < 0.05），Cre和BUN明显降低（P < 0.05），高剂量芦丁组肾指数明显降低（P < 0.05）。与正常组比较，模型组小鼠肾组织损伤严重，肾小球严重萎缩，肾组织纤维化程度严重，肾小球基底膜弥漫性增厚，足突融合甚至消失；与模型组比较，低、高剂量芦丁组小鼠症状明显改善，高剂量芦丁组小鼠改善效果最为明显。结论: 芦丁可改善STZ诱导的糖尿病小鼠肾功能，减轻糖尿病小鼠肾组织损害程度。
关键词: 芦丁    糖尿病, 实验性    肾组织形态    
Influence of rutin in renal tissue morphology in STZ-induced diabetes mice
BAI Jing1, JI Xiaoru1, HAN Ting1, AN Chunna1, GOU Xiangbo1, SU Peng2, WANG Yan2     
1. Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;
2. Jitang School, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China
[Abstract]: Objective: To study the influence of rutin in the morphology of renal tissue of the diabetic mice induced by streptozotocin(STZ), and to clarify the effect of rutin on the kidney tissue damage. Methods: Twelve mice of the total 70 Kunming mice were used as normal group, the other were used to estabish type 1 diabetes mouse models by intraperitoneally injected with STZ (62.5 mg·kg-1), once daily for 5 d. The successfully established model mice were randomly divided into model group, low dose (50mg·kg-1)of rutin group, high dose (100 mg·kg-1) of rutin group and irbesartan group (45 mg·kg-1). The mice in model group and normal group were given the carboxy methyl cellulose(CMC) and the other mice were given drugs by intragastric administration once daily for 8 weeks accordingly. The weight and blood glucose of the each mouse were determined.Full automatic biochemical analyzer was used to detect the levels of serum creatinine (Cre) and blood urine nitrogen (BUN) of the mice, and the kidney index was calculated. The morphology of renal tissue was observed by HE staining, Masson staining and electron microscope. Results: After injection of STZ, the model success rate was up to 98%.Compared with normal group, there was no significant difference in the weight of the mice in other groups before administration(P>0.05).After administration of rutin, the weights of the mice in model group, low dose of rutin group, high dose of rutin group and irbesartan group were significantly decreased (P < 0.05). Compared with model group, the levels of blood glucose of the mice in low and high doses of rutin groups were significantly decreased(P < 0.05);the levels of Cre and BUN were significantly reduced (P < 0.05);the kidney index of the mice in high dose of rutin group was significantly decreased (P < 0.05). Compared with normal group, the kidney tissue of the mice in model group was seriously damaged; glomerular was weaked, the kidney tissue fibrosis was serious, glomerular basement membrane was diffusely thickened and foot process was coalesced or overgrow. Compared with model group, the degree of injury of the mice in low and high doses of rutin groups were significantly improved, especially in high dose of rutin group. Conclusion: Rutin can improve the renal function of diabetic mice induced by STZ and reduce the degree of renal tissue damage in the diabetic mice
Key words: rutin     diabetes mellitus, experimental     renal morphology    

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见且最严重的微血管并发症之一[1-2]。现阶段治疗主要是根据病期的不同采取相应的措施，如控制血糖以改善肾血流动力学，采用罗格列酮及厄贝沙坦药物治疗等。对早期DN的治疗，抑制早期DN患者的病变，减慢其向终末期肾病的发展速度，对于延缓DN的进展具有重要意义[3]。

黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，广泛存在于多种植物中，本研究室前期研究[4-7]显示：黄酮类化合物具有降糖、降脂、抗氧化和清除自由基等作用。芦丁为荞麦黄酮的主要成分之一，研究[8-10]表明：芦丁具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、降糖、降脂及心脑血管保护等多种功效，临床上早期主要用于防治脑出血等疾病。近年国内外学者报道芦丁具有降糖降脂作用，并取得了许多重要成果，但尚未见芦丁对糖尿病小鼠肾组织损害治疗作用的报道。本实验通过建立1型糖尿病小鼠模型，探讨芦丁对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠肾组织形态表现的影响及治疗作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物、药品与试剂

健康普通级雄性昆明小鼠70只，体质量(35±10) g，军事医学科学院卫生学环境医学研究所培养，动物许可证号：0000349。STZ(德国VETEC公司)，羧甲基纤维素钠(CMC，国药集团化学试剂有限公司)，芦丁(英国Abcam公司)，厄贝沙坦片[批号5A195，赛诺菲(杭州)制药有限公司]，Masson三色染色试剂盒(中国Solarbio公司)。

1.2 主要仪器

5D系列血糖仪和血糖仪试纸[京药监械(准)字2012第2400599号，北京怡成生物电子技术股份有限公司], Chemray 240型全自动生化分析仪(美国Rayto公司)，低温高速离心机(德国Eppendorf公司)，BX-53型光学显微镜(日本O lympus公司)，日立H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.3 1型糖尿病小鼠模型的建立和给药

70只健康雄性昆明小鼠在动物实验中心开放性饲养1周，其中12只小鼠作为正常组，其余58只小鼠制备1型糖尿病模型。小鼠腹腔注射62.5mg·kg-1STZ，每日1次，连续5d；72h后尾部静脉取血测定小鼠血糖水平，随机餐后血糖水平大于16.6mmol·L-1即认为造模成功。造模成功57只小鼠，成模率为98%。随机选取48只造模成功小鼠分为模型组、低剂量芦丁组、高剂量芦丁组和厄贝沙坦组，每组12只。厄贝沙坦组小鼠给予45mg·kg-1厄贝沙坦混悬液，低剂量芦丁组小鼠给予50mg·kg-1芦丁，高剂量芦丁组小鼠给予100mg·kg-1芦丁[11]，正常组和模型组小鼠给予10mg·kg-1 0.1%CMC。各组小鼠均经口灌胃给药，每日1次，持续8周。

1.4 实验指标检测

8周后，小鼠尾静脉取血采用血糖仪测定各组小鼠的随机血糖，称量各组小鼠体质量；各组小鼠禁食12h，麻醉后摘除眼球取血，4℃、3000r·min-1离心10 min，吸取上清液，采用Rayto全自动生化分析仪测定血肌酐(Cre)和尿素氮(BUN)。小鼠处死后立即对其进行解剖，迅速摘取两侧肾脏，去除表面被膜，经生理盐水清洗，滤纸吸干后称质量，一部分放入4%多聚甲醛中固定，一部分放入2%戊二醛中保存；计算肾脏指数，肾脏指数=双肾平均肾质量(mg)/体质量(g)。

1.5 光镜和电镜下观察肾组织形态表现

4%多聚甲醛固定肾脏组织，冲水，梯度酒精脱水、二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片，HE染色及Masson染色，光镜下观察肾组织形态表现和肾组织纤维化程度。2.5%戊二醛固定肾组织，采用透射电镜观察肾组织超微结构。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠体质量、血糖、血Cre、血BUN和肾脏指数均以x± s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 给药前后各组小鼠体质量

给药前各组小鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与正常组比较，给药后各组小鼠体质量均明显下降(P＜0.05)。见表 1。

表 1 给药前后各组小鼠体质量 Table 1 Body weights of mice in various groups before and after administration
(n=12, x± s, m/g)
GroupDose(mg·kg-1)Bodyweight before adminstrationBodyweight after administration
4 week8 week
Normal040.88±0.9142.64±1.99 45.37±2.34
Model040.60±1.8637.19±2.77*38.43±3.84*
Rutin
  Low dose5042.60±1.5635.80±3.31*36.81±2.50*
  High dose10041.84±1.2434.45±2.87*35.69±2.95*
Irbesartan4542.00±2.3736.05±1.93*34.57±2.17*
*P < 0.05 vs normal group.
表选项
2.2 给药前后各组小鼠餐后血糖水平

与正常组比较，给药前模型组、低剂量芦丁组、高剂量芦丁组和厄贝沙坦组小鼠血糖水平明显升高(P＜0.05)。给药4周后，与模型组比较，低、高剂量芦丁组小鼠血糖水平明显降低(P＜0.05)；与厄贝沙坦组比较，低、高剂量芦丁组小鼠血糖水平也明显降低(P＜0.05)；8周后血糖水平下降不明显。见表 2。

表 2 给药前后各组小鼠餐后血糖水平 Table 2 Levels of blood glucose of mice in various groups before and after administration
[n=12, x± s, cB/(mmol·L-1)]
GroupDose(mg·kg-1)Blood glucose before administrationBlood glucose afteradministration
4 week8 week
Normal07.41±10.115.12±0.806.88±1.50
Model022.74±5.93*25.07±3.23*24.40±2.63*
Rutin
  Low dose5019.56±2.34*19.47±2.58*△#21.64±1.43*
  High dose10018.87±5.88*19.98±2.86*△#22.10±1.73*
Irbesartan4520.83±6.31*24.25±4.53*24.40±3.41*
*P < 0.05 vs normalgroup; △P < 0.05 vs modelgroup; #P < 0.05 vs Irrbesartan group.
表选项
2.3 各组小鼠肾功能指标

与正常组比较，模型组小鼠血Cre、BUN和肾脏指数均明显升高(P＜0.05)；与模型组比较，各剂量芦丁组小鼠血Cre和BUN水平明显降低(P＜0.05)，厄贝沙坦组小鼠血BUN水平下降不明显(P>0.05)；与模型组比较，高剂量芦丁组小鼠肾脏指数明显降低(P＜0.05)，低剂量芦丁组和厄贝沙坦组小鼠肾脏指数下降不明显(P>0.05)。见表 3。

表 3 各组小鼠肾功能指标 Table 3 Indexes ofkidney function of mice in various groups
(n=12，x± s)
GroupDose
(mg·kg-1)		Cre
[cB/(μmol·L-1)]		BUN
[cB/(mmol·L-11)]		Kidney index
Normal025.20±3.408.67±1.606.22±0.63
Model037.00±6.30*23.93±7.16*7.86±0.47*
Rutin
  Low dose5029.83±5.67△14.61±7.51△7.26±0.73*
  High dose10029.20±4.60△14.07±5.84△6.98±0.69△
Irbesartan4527.00±4.00△18.16±4.90*7.13±0.82*
*P < 0.05 vs normal group; △P < 0.05 vs model group.
表选项
2.4 各组小鼠肾组织形态表现

给药8周后，正常组小鼠肾组织中的肾小球及肾小管形态正常；与正常组比较，模型组小鼠细胞核增多，系膜区增宽，肾小球固缩明显，囊腔增大；与模型组比较，各剂量芦丁组和厄贝沙坦组小鼠上述情况均明显改善。见图 1(插页四)。

A:Normal group; B:Model group; C:Low dose of rutin group; D:High dose of rutin group; E:Irbesartan group. 图 1 各组小鼠肾组织形态表现(HE, ×400) Figure 1 Morphology of kidney tissue of mice in various groups(HE, ×400)
图选项
2.5 各组小鼠肾组织纤维化程度

给药8周后, 正常组小鼠肾小球清晰，大小正常，仅在肾小球基底处有少许被染成蓝色的胶原纤维，纤维化程度极低; 与正常组比较，模型组小鼠肾间质蓝染胶原纤维增多，组织纤维化程度严重；与模型组比较，各剂量芦丁组和厄贝沙坦组小鼠肾组织纤维化程度均有不同程度的改善。见图 2(插页四)。

A:Normal group; B:Model group; C:Low dose of rutin group; D:High dose of rutin group; E:Irbesartan group. 图 2 各组小鼠肾组织Masson染色结果(×400) Figure 2 Results of Masson staining of kidney tissue of mice in various groups(×400)
图选项
2.6 各组小鼠肾组织超微结构

给药8周后，电镜下观察：正常组小鼠肾组织中肾小球基底膜厚度均匀、平滑，足细胞结构完整，足突排列整齐清晰，无融合现象；与正常组比较，模型组小鼠肾小球基底膜弥漫性增厚，足细胞数量减少，足突排列不整齐、增宽，出现融合甚至消失；与模型组比较，各剂量芦丁组和厄贝沙坦组小鼠肾组织上述现象均不同程度改善，高剂量芦丁组改善情况最明显。见图 3。

A:Normal group; B:Modelgroup; C:Lowdose of rutin group; D:Highdose of rutin group; E:Irbesartangroup. 图 3 各组小鼠肾组织超微结构(bar=2 μm) Figure 3 Ultrastructures of kidney tissue of mice in various groups (bar=2 μm)
图选项
3 讨论

近年来，越来越多的糖尿病患者死于DN，延缓DN病程及控制DN患者的血糖目前仍以药物为主，选用的药物要对肾损伤小且肾负担小[12-13]。研究[14]表明：芦丁具有降糖、降脂、抗炎、抗肿瘤和抗氧化作用。肾组织纤维化是DN的常见表现，是慢性肾病转化为肾功能衰竭的主要病理特征和共同途径[15]。由于HE染色不能清晰地显示出肾组织胶原纤维，难以辨别轻度的纤维化，故采用Massson染色来观察肾组织纤维化的程度。Massson染色是传统的经典胶原纤维染色法，在慢性炎症和机化等病变中可出现胶原纤维增生，Massson染色可以辅助HE染色判断组织纤维化程度，此法在病理诊断、疾病鉴别及研究工作中有非常重要的作用。足细胞是高度分化的细胞，不可再生，足细胞损伤在DN中有重要意义，足细胞数量减少和肾组织基底膜增厚造成的肾小球滤过屏障破坏无法修复[16]。

本研究采用腹腔注射STZ破坏小鼠体内胰岛β细胞，制备1型糖尿病模型，测定造模后小鼠的随机血糖浓度，大于16.6mmol·L-1者视为造模成功，此法成模率高达98%。本研究中与正常组比较，其余各组小鼠血糖水平均明显升高；低、高剂量芦丁组小鼠的精神状态较模型组小鼠改善明显，多饮、多食和多尿症状减缓；与正常组比较，模型组小鼠血Cre、BUN和肾脏指数明显升高，表明该造模方式能造成肾损害；与模型组比较，低、高剂量芦丁组小鼠血Cre与BUN水平和肾脏指数均明显降低，表明芦丁可在一定程度上减轻肾损害，且有一定的降血糖功效，给予较高剂量芦丁治疗效果更为明显。本研究中光镜及电镜观察结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肾组织的形态表现为细胞核增多、系膜区扩张和肾小球固缩，肾小球系膜细胞增殖及肾小管间质纤维化，肾小球基底膜弥漫性增厚，足细胞数量减少，足突排列不整齐、增宽，出现融合甚至消失等；与模型组比较，各治疗组小鼠上述情况均明显改善。本研究组织形态表现观察结果表明：芦丁对糖尿病小鼠肾脏有一定的保护作用。本研究结果为采用芦丁治疗DN、改善肾组织形态表现提供了依据。

综上所述，芦丁可降低糖尿病小鼠血糖，减缓糖尿病的症状，改变肾组织形态，并能降低Cre、BUN水平和肾脏指数，从而改善STZ诱导的糖尿病小鼠肾功能和肾组织的损害程度，对高血糖引起的肾疾病有一定的治疗作用。

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