吉林大学学报(医学版)  2017, Vol. 43 Issue (04): 709-714

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孙静, 魏虎来
SUN Jing, WEI Hulai
人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗和逆转模型中FoxO1mRNA和蛋白表达水平及其意义
Insulin resistance of human hepatoma HepG2 cells and expression levels of FoxO1 mRNA and protein in reversal model and their significances
吉林大学学报(医学版), 2017, 43(04): 709-714
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(04): 709-714
10.13481/j.1671-587x.20170409

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收稿日期: 2016-11-08
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孙静, 魏虎来. 人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗和逆转模型中FoxO1mRNA和蛋白表达水平及其意义[J]. 吉林大学学报(医学版), 2017, 43(04): 709-714.
SUN Jing, WEI Hulai. Insulin resistance of human hepatoma HepG2 cells and expression levels of FoxO1 mRNA and protein in reversal model and their significances[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2017, 43(04): 709-714.
人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗和逆转模型中FoxO1mRNA和蛋白表达水平及其意义
孙静1 , 魏虎来2     
1. 兰州大学第二医院内分泌代谢科, 甘肃 兰州 730000;
2. 兰州大学基础医学院医学实验中心, 甘肃 兰州 730000
收稿日期: 2016-11-08
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金资助课题（861174）；甘肃省科技厅自然科学基金青年科研基金资助课题（1308RJYA065）；甘肃省卫计委卫生行业计划项目资助课题（GSWSKY-2015-64）
作者简介: 孙静(1980-), 女, 黑龙江省哈尔滨市人, 副主任医师, 在读医学博士, 主要从事糖尿病及糖尿病肾病基础和临床方面的研究。
通信作者: 魏虎来, 教授, 博士研究生导师(Tel:0931-8915082, E-mail:weihulai@lzu.edu.cn)
[摘要]: 目的: 探讨人源肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗（IR）模型（HepG2/IR）和逆转模型（HepG2/IR-PH）中叉头状转录因子O1（FoxO1）的mRNA和蛋白表达水平，阐明该基因参与IR的作用机制。方法: 选择人源肝癌HepG2细胞，采用终浓度1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol·L-1胰岛素诱导24、48和72 h，对照组细胞不加胰岛素，用葡萄糖氧化酶法检测上清液中葡萄糖水平，计算各组细胞的葡萄糖消耗量，以确定IR模型建立的最佳诱导条件；采用终浓度为0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000mmol·L-1盐酸吡咯列酮（PH）诱导HepG2建立逆转抵抗模型，同时设立对照组，MTT法检测细胞增殖活性，确定PH的最佳逆转浓度；利用Real-time PCR法和Western blotting法检测各组细胞FoxO1 mRNA和蛋白表达水平。结果: 1×10-7 mol·L-1胰岛素作用36 h，葡萄糖消耗量减少45.84%，发生明显的IR，与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，1.25 mmol·L-1PH逆转抵抗24 h，细胞增殖活性无明显变化（P>0.05）。人源肝癌HepG2细胞发生IR时，与对照组比较，FoxO1 mRNA和蛋白的表达水平均明显升高（P < 0.01）；IR模型逆转后，与对照组比较，FoxO1mRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论: 人源肝癌HepG2细胞IR与FoxO1mRNA的表达有关联性，FoxO1 mRNA表达水平检测有可能作为胰岛素增敏剂的药效评估指标，降低FoxO1 mRNA表达水平可作为2型糖尿病治疗的新靶点。
关键词: 人源肝癌HepG2细胞    胰岛素抵抗    胰岛素抵抗逆转    叉头状转录因子O1基因    
Insulin resistance of human hepatoma HepG2 cells and expression levels of FoxO1 mRNA and protein in reversal model and their significances
SUN Jing1, WEI Hulai2     
1. Department of Endocrinology and Metabolism, Second Hospital, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;
2. Center of Medical Laboratory, College of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
[Abstract]: Objective: To study the expression levels of forkhead transcription factor(FoxO1) mRNA and protein in the insulin resistance (IR) HepG2 cells model (HepG2/IR) and IR reversal HepG2 cells model (HepG2/IR-PH), and to explore its mechanism in IR. Methods: The HepG2/IR was induced with different doses of insulin (1×10-10, 1×10-9, 1×10-8, 1×10-7, 1×10-6 and 1×10-5 mol·L-1) for different time(24, 36 and 48 h)in the HepG2 cells.The cells in control group were not treated with insulin. The glucose levels in supernant were determined by glucose oxidase method, and the glucose consumption in HepG2 in various groups were calculated to confirm the optimum induction conditions of HepG2/IR. The HepG2/IR-PH was induced with different doses of pioglitazone hydrochloride (PH) (0.156, 0.313, 0.625, 1.250, 2.500, 5.000, 10.000 and 20.000 mmol·L-1) in the HepG2 cells, and control group was set up at the same time. The proliferation activities of cells were observed by MTT assay to confirm the optimum reversal concentration of PH. The FoxO1 mRNA and protein expression levels were detected by Real-time PCR and Western blotting methods. Results: The glucose consumption decreased by 45.84% in HepG2/IR after treated with 1×10-7 mol·L-1 insulin for 36 h, and there was significant difference compared with control group(P < 0.05), the proliferation activity of cells had no change in the HepG2/IR-PH after treated with 1.25 mmol·L-1 PH for 24 h(P>0.05).Compared with control group, the expression levels of FoxO1 mRNA and protein in HepG2/IR were significantly increased(P < 0.01); compared with control group, the expression levels of FoxO1 mRNA and protein in HepG2/IR-PH had no significant differences(P>0.05). Conclusion: The IR of HepG2/IR is associated with the FoxO1 mRNA expression. The detection of FoxO1 mRNA seems to be an indicator to evaluate the efficacy of insulin sensitizer, and inhibiting the expression of FoxO1 mRNA may be developed as a potential therapy for type 2 diabetes.
Key words: HepG2 cells     insulin resistance     insulin resistance reversal     forkhead transcription factor    

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是指机体、器官、组织或细胞对胰岛素的敏感性和反应性降低，糖代谢紊乱的慢性病理过程，是引发2型糖尿病的主要原因之一[1]。叉头状转录因子Os(forkhead transcription factor Os，FoxOs)是激素和营养代谢调节通路中的关键因子，参与肝脏糖异生、糖酵解和脂肪生成[2]。叉头状转录因子O1(forkhead transcription factor O1，FoxO1) 是FoxOs家族中的一员，是胰岛素通路的重要转录因子。文献[3]报道：FoxO1基因与细胞的糖脂代谢和糖异生过程关系密切，但FoxO1是否参与IR目前报道较少。本研究通过体外诱导建立人源肝癌HepG2细胞IR模型和盐酸吡格列酮(pioglitazone hydrochloride，PH)干预后的逆转模型，采用Real-time PCR法及Western blotting法检测HepG2细胞IR模型及逆转模型中FoxO1mRNA和蛋白表达水平，探讨该基因参与IR的机制。

1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂

人源肝癌HepG2细胞购自北京北纳创联生物技术研究院，源自美国模式菌种收集中心(ADCC)，由兰州大学基础医学院实验中心保存。无酚红DMEM培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，0.25%胰酶和青链霉素双抗(美国Hyclone公司)，葡萄糖检测试剂盒(南京威特曼生物科技有限公司)，Trizol Plus、逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒(大连TaKaRa公司)，兔抗人FoxO1多克隆抗体(美国Immunoway公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗体和HRP标记羊抗兔多克隆抗体(北京中杉金桥有限公司)，细胞蛋白裂解液和BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，ECL发光液(美国Millipore公司)。

1.2 HepG2细胞培养

HepG2细胞复苏，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基转入25cm2细胞培养瓶中，37℃、5%CO2的饱和湿度条件下培养，当细胞贴壁生长到90%铺满度之后，弃掉培养基，灭菌PBS洗涤，0.25%胰酶消化，每隔1d按1:3比例传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 HepG2细胞IR模型的诱导和模型建立

根据陈秋[6]建立模型的方法并改进，将处于对数生长期的人源肝癌HepG2细胞置于完全培养基中，按每孔5×103个细胞接种于96孔板，待细胞完全贴壁后更换无血清DMEM培养基洗涤并同步化24 h，更换含5%小牛血清的培养基。实验组分别加入终浓度为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5 mol·L-1胰岛素，对照组不加胰岛素。分别诱导24、36和48 h，弃上清并用PBS洗涤去除胰岛素，用不含血清的无酚红DMEM孵育24 h，吸取上清，用葡萄糖氧化酶法测定其中的葡萄糖水平，根据培养基原始葡萄糖水平减去各组上清中的葡萄糖水平，计算各组细胞的糖消耗量，选取葡萄糖消耗量下降明显且细胞状态良好的诱导条件。胰岛素诱导建立的IR细胞命名为HepG2/IR细胞，终浓度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5 mol·L-1胰岛素诱导36 h的细胞组依次命名为HepG2/IR-5、HepG2/IR-6、HepG2/IR-7、HepG2/IR-8和HepG2/IR-9细胞组，对照组不加胰岛素。

1.4 HepG2细胞IR逆转模型的建立

PH是胰岛素的增敏剂，可逆转IR。收集HepG2/IR细胞并按1×105mL-1浓度接种于96孔板，以HepG2/IR为对照组，分别用终浓度为0.156、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000和20.000 mmol·L-1的PH完全培养基作用24 h后，采用MTT法检测对应每孔570nm处吸光度(A)值，代表细胞增殖活性。根据细胞增殖活性判断最佳PH作用浓度，IR逆转模型细胞命名为HepG2/IR-PH。

1.5 RT-PCR法检测FoxO1 mRNA表达水平

收集HepG2/IR-5、HepG2/IR-6、HepG2/IR-7、HepG2/IR-8、HepG2/IR-9、HepG2/IR-PH组和对照组细胞，提取总RNA，测定RNA水平，反转录为cDNA，建立PCR扩增体系。FoxO1引物序列：forward 5′-ACAGACCAACCTGGCATTAC-3′，reverse 5′-TACGTCCTGATGGGACTTACA-3′；内参β-actin引物序列：forward 5′-TTGCTGATCCACATCTGCT-3′，reverse 5′-GACAGGATGCAGAAGGAG AT-3′。Real-time PCR反应条件：95℃、10 s，60℃、30 s，72℃、30s，共40个循环。熔解曲线温度为60℃~95℃，设置3个复孔。采用ABI7500型荧光定量PCR仪及分析软件进行PCR扩增及相对定量分析，扩增结束后采用熔解曲线分析产物的特异性。目的基因的相对表达水平F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=对照组(Ct管家基因－Ct目的基因)－实验组(Ct管家基因－Ct目的基因)。

1.6 Western-blotting法检测FoxO1蛋白表达水平

收集HepG2/IR-5、HepG2/IR-6、HepG2/IR-7、HepG2/IR-8、HepG2/IR-9、HepG2/IR-PH组和对照组细胞，裂解，提取全细胞蛋白裂解液，BCA定量测定蛋白浓度，每孔10μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳，湿转法将蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃过夜孵育一抗(兔抗人FoxO1多克隆抗体，兔抗人GAPDH多克隆抗体)，TBST洗涤10 min×3次，加入二抗(HRP标记羊抗兔多克隆抗体)室温孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次，加入ECL发光液并置于暗盒内压片，再将X光片置于定影液和显影液中显色，自来水清洗后晾干。扫描仪扫描成像，Image J软件对蛋白进行灰度分析，以GAPDH作为对照，计算各组细胞中FoxO1蛋白的表达水平，蛋白表达水平=待测蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS19统计学软件进行统计学分析。葡萄糖消耗量、细胞增殖活性、FoxO1 mRNA和蛋白表达水平均以x± s表示，多组间比较采用单因素方差分析。细胞增殖活性为非正态分布资料，经对数转换正态化后组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组HepG2细胞葡萄糖消耗量

与对照组比较，胰岛素作用24 h，各浓度胰岛素组细胞葡萄糖消耗量均增加；培养36 h后，1×10-8、1×10-7和1×10-6 mol·L-1胰岛素组细胞的葡萄糖消耗量均较对照组减少(P < 0.05)，产生了IR，其中1×10-7 mol·L-1胰岛素组比对照组减少45.84%；胰岛素作用48 h后，各浓度胰岛素组葡萄糖消耗量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

表 1 不同浓度胰岛素作用不同时间人源肝癌HepG2细胞葡萄糖消耗量 Table 1 Glucose consumption of human hepatoma HepG2 cells after treated with different concentrations of insulin for different time
[n=4, x± s, cB/(mmol·L-1)]
GroupGlucose consumption
(t/h)244872
Control0.884±0.1930.925±0.0752.037±0.161
Insulin model (mol·L-1)
1×10-101.072±0.2391.117±0.077△2.229±0.187
1×10-91.292±0.197*1.127±0.105△2.296±0.192
1×10-81.396±0.154*0.803±0.015*△2.293±0.168
1×10-71.480±0.197*0.501±0.055*1.794±0.115
1×10-61.516±0.122*0.719±0.071*△1.899±0.107
1×10-51.705±0.168*1.224±0.089*△2.271±0.221
*P < 0.05 compared with control group at same time; △P < 0.05 compared with 1×10－7 mol·L-1 insulin model group.
表选项
2.2 不同浓度PH逆转IR后各组细胞增殖活性

以1×10-7 mol·L-1胰岛素培养36 h作为逆转IR的对照组细胞，当PH浓度低于1.25 mmol·L-1时，对细胞增殖均无明显影响，故后续实验选择1.25 mmol·L-1 PH逆转HepG2/IR细胞的IR。见表 2。

表 2 不同浓度PH逆转IR后各组细胞增殖活性 Table 2 Proliferation activities of HepG2 cells with IR reversed by different concentrations of PH in various groups
(n=4, x± s)
GroupA value
Control1.328±0.029
PH model (mmol·L－1)
  0.1561.334±0.056
  0.3121.327±0.072
  0.6251.330±0.138
  1.2501.341±0.067
  2.5001.154±0.093*
  5.0000.874±0.077*
  10.0000.709±0.053*
  20.0000.345±0.098*
*P < 0.05 compared with control group.
表选项
2.3 各组HepG2/IR细胞中FoxO1 mRNA的表达水平

与对照组比较，HepG2/IR-6、HepG2/IR-7和HepG2/IR-8组HepG2/IR细胞中FoxO1 mRNA表达水平明显升高(P < 0.01), 其中HepG2/IR-7组表达水平最高；PH逆转HepG2/IR细胞IR时(HepG2/IR-7-PH组)，较HepG2/IR-7组FoxO1 mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。

表 3 各组细胞中FoxO1 mRNA表达水平 Table 3 Expression levels of FoxO1 mRNA in cells in various groups
(n=4, x± s)
GroupExpression level of FoxO1 mRNA
Control1.01±0.77
HepG2/IR-51.08±0.96△
HepG2/IR-629.35±2.76*△
HepG2/IR-734.16±1.89*
HepG2/IR-819.34±2.42*△
HepG2/IR-92.37±0.85△
HepG2/IR-7-PH2.01±0.06△
*P < 0.05 compared with control group; △P < 0.01 compared with HepG2/IR-7 group
表选项
2.4 各组HepG2/IR细胞中FoxO1蛋白表达水平

与对照组比较，HepG2/IR-5、HepG2/IR-6、HepG2/IR-7和HepG2/IR-8组FoxO1蛋白表达水平明显增加(P < 0.01)，其中HepG2/IR-7组表达水平最高，与FoxO1 mRNA表达变化相吻合。PH逆转HepG2/IR细胞IR后(HepG2/IR-7-PH组) FoxO1蛋白表达水平与HepG2/IR-7组比较明显降低(P < 0.01)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图 1和表 4。

Lane 1: Control group; Lane 2: HepG2/IR-5 group; Lane 3: HepG2/IR-6 group; Lane 4: HepG2/IR-7 group; Lane 5: HepG2/IR-8 group; Lane 6: HepG2/IR-9 group; Lane 7: HepG2/IR-7-PH group. 图 1 Western blotting法检测各组细胞中FoxO1蛋白表达电泳图 Figure 1 Electrophoregram of expressions of FoxO1 protein in cells in various groups detected by Western blotting method
图选项
表 4 各组细胞中FoxO1蛋白表达水平 Table 4 Expression levels of FoxO1 protein in HepG2 cells in various groups
(n=4, x± s)
GroupExpression level of FoxO1 protein
Control0.033±0.004
HepG2/IR-50.231±0.074*△
HepG2/IR-60.460±0.031*△
HepG2/IR-70.660±0.071*
HepG2/IR-80.481±0.026*△
HepG2/IR-90.207±0.009*△
HepG2/IR-7-PH0.114±0.078△
*P < 0.01 compared with control group; △P < 0.01 compared with HepG2/IR-7 group.
表选项
3 讨论

1995年Stern[4]提出了著名的“共同土壤”学说，认为糖尿病、高血压和冠心病是在IR这个共同土壤中“生长”出来的，即IR是这些疾病的共同危险因素。

由于IR的研究常需要取肝脏和骨骼肌等胰岛素靶组织，使其在人体的研究不易开展，因此国外关于IR的研究多以细胞或动物模型为对象，尤其是IR细胞模型，因具有复制周期短、易多次重复、影响因素容易控制及价格低廉等优势已被较广泛应用[5]。

HepG2细胞源于人的肝胚胎瘤细胞, 是一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，常被选为研究对象，国内多采用高胰岛素诱导HepG2细胞建立IR细胞模型[6]。本实验采用终浓度为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5 mol·L-1胰岛素，诱导HepG2细胞24、36和48h，用葡萄糖氧化酶法测定检测上清液中葡萄糖浓度，计算各组细胞的葡萄糖消耗量，确定IR模型建立的最佳诱导条件为1×10-7 mol·L-1胰岛素诱导36 h，表现出明显的IR。

FoxOs蛋白家族是新近发现并命名的新转录因子家族，FoxO1蛋白作为FoxOs亚家族中的一员，是细胞内能量代谢的重要调节因子，同时也是胰岛素/胰岛素样生长因子1信号通路中的关键分子[7]。FoxO1广泛表达于肝脏、脂肪和骨骼肌等糖、脂代谢器官和组织中，不同组织中FoxO1的功能有所差异。在肝脏中，FoxO1主要参与糖异生及极低密度脂蛋白的合成，在维持机体血糖水平稳定及甘油三酯代谢过程中发挥重要作用[8-9]。在高脂饮食的小鼠中，FoxO1蛋白水平增加，降低胰岛素的敏感性[10]。在肥胖小鼠中，沉默FoxO1的表达可以逆转肝脏糖异生和肝糖原的输出[11]。研究[12-14]显示：FoxO1表达升高可上调糖异生途径关键酶的表达，影响肝脏葡萄糖输出，抑制糖尿病小鼠FoxO1基因表达后其血糖水平明显下降，且肝脏组织糖异生途径关键酶的表达水平降低，表明FoxO1表达异常可能与IR有重要关系。但目前关于FoxO1与IR关系的研究尚少，抑制表达能否改善IR及其详细机制尚不明确。

PH作为噻唑烷二酮家族成员之一和过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活剂的代表性药物，属于胰岛素增敏剂，因可以改善胰岛素敏感性及血管内皮功能，增强胰岛素与其受体结合以促进组织对葡萄糖的摄取而降低血糖，在目前的临床工作中作为2型糖尿病的治疗药物已经得到了认可[1, 15-16]。但PH能否降低FoxO1而增加胰岛素敏感性，目前研究甚少。

本研究检测人源肝癌HepG2细胞IR模型中FoxO1 mRNA及蛋白表达水平结果显示：在HepG2/IR模型细胞中FoxO1 mRNA和蛋白表达水平明显升高，采用PH进行HepG2/IR模型逆转抵抗后，与HepG2/IR细胞组比较，逆转模型细胞中FoxO1 mRNA和蛋白表达水平降低，提示FoxO1基因在细胞发生IR的过程中发挥重要作用，说明FoxO1的表达水平与细胞对胰岛素的敏感性存在着关联性。因此，FoxO1基因有可能作为IR的建模分子指标、胰岛素增敏剂的药物筛选靶标及药效评估的分子指标，同时为IR的治疗提供一定理论依据。

综上所述，本研究结果表明FoxO1表达与IR存在关联性，FoxO1 mRNA表达水平检测有可能作为胰岛素增敏剂的药效评估指标，降低FoxO1 mRNA表达水平可作为2型糖尿病治疗的新靶点，但是FoxO1基因与胰岛素敏感性具体的分子效应机制还需要进一步验证。

参考文献
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