研究^[1-2]显示：甲状腺癌在全球范围的发病率呈明显上升趋势，其中以甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)为主^[3]。PTC是甲状腺癌中发生率最高的一种病理类型，占甲状腺恶性肿瘤的90%^[4-6]。尽管PTC恶性程度低，治愈率高，但仅微乳头状癌在中央区淋巴结的转移概率可达24%~64%，并有较高的复发率和死亡率^[7-8]，因此寻找能鉴别良恶性结节、评估预后和指导治疗的特异性肿瘤标记物非常重要。近年来，随着分子生物学技术的发展，甲状腺癌相关性生物分子研究进展较快，如Ras基因、BRAF基因、p53基因、半乳糖凝集素3、基质金属蛋白酶1/金属蛋白酶组织抑制因子1和Ki-67等。在影响甲状腺癌发生发展的诸多因素中，Ki-67和BRAF基因突变是近年来的研究热点。研究^[9-10]显示：Ki-67和BRAF基因突变与PTC的生物学特性有关联，如浸润、转移及肿瘤分期等，有助于分析患者的预后情况。而国内对Ki-67和BRAF基因突变与PTC患者临床预后关系的报道相对较少，且结论不一。本研究旨在结合国内外最新研究进展，就Ki-67和BRAF基因突变在PTC发生发展中的作用及其对肿瘤侵袭性、临床诊断及预后方面的影响进行综述。

1 Ki-67抗原 1.1 Ki-67抗原的结构、功能和生物学特性

Ki-67是1983年Gerdes等^[11]采用鼠源单克隆抗体检测一种来自霍奇金淋巴瘤系细胞核抗原时首次发现，由相对分子质量为345 000和395 000的2条多肽链组成的核蛋白，为9 768 bp和8 686 bp 2个相连接的mRNA所编码^[12]。Ki-67具有2个核内定位点和8个双向核靶信号，由磷酸化部位(200个以上)、N-豆寇酰化部位(19个)及肽酰化(3个)部位组成，羧基端有ATP/GTP结合区，由含有脯氨酸(Pro)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)的50个PGST结构区组成, 其结构具有非组蛋白的特点，对蛋白酶敏感度高，提取困难, 而PGST区又容易降解，因此Ki-67的半衰期较短(只有60~90 min)。

Ki-67是与细胞增殖周期有关的核蛋白，仅定位于增殖细胞核的基质中。Ki-67可在除静止期G₀期外的任何细胞周期表达，起始于G₁期，并于S期和G₂期逐渐增加，于M期达高峰，迅速消失于分裂晚期。Ki-67的分布具有细胞周期依赖性，其在G₁期细胞中表达于细胞核仁周边，在S和G₂早期细胞中表达于细胞核中，在M早期细胞中表达于染色体上。因为Ki-67只表达于增殖期细胞中，而不表达于静止期细胞中，所以Ki-67可用于识别生长中的细胞，反映细胞群体增殖活性，也是目前较为肯定的反映肿瘤细胞增殖活性的标记物之一。因为Ki-67独特的结构，与其进行比对研究的同源序列缺失，目前仍未能完全了解其生物学功能。Ki-67的功能与染色体紧密相连，在有丝分裂中维持DNA结构的功能，并且可能与rRNA聚合酶Ⅰ的早期合成密切相关，是细胞分裂中核糖体合成的关键因子。研究者^[13]认为：Ki-67可与其他肿瘤基因或生物分子相协同或拮抗，对肿瘤的发生发展起促进作用。Ki-67之所以能更好地反映肿瘤的恶性程度及患者的预后情况，是因为与其他类似反映细胞增殖的标记物比较，Ki-67具有细胞脱离增殖周期后能迅速降解且半衰期短的特点。

1.2 Ki-67基因突变与PTC侵袭性的关系

细胞失控性的分裂和增殖是肿瘤恶变的基础，亦为肿瘤细胞恶性程度的主要表现，Ki-67是细胞增殖活跃的重要标志。研究^[14-15]已经证实：Ki-67基因在正常的组织中不表达，在癌变组织中强表达，而在恶变初期组织中有微弱的表达，表达水平随着疾病发展呈梯度上升，说明Ki-67的异常表达影响肿瘤的发生发展，并且对肿瘤的增殖、浸润、转移和预后起重要作用。Ki-67可作为鉴别肿瘤性质和判定肿瘤侵袭力的重要标志，这一观点在宫颈癌^[16]、乳腺癌^[17]、肺癌^[18]和淋巴瘤^[19]等研究中已得到证实。因为Ki-67与各种常见恶性肿瘤均有关联性，所以PTC组织中Ki-67的异常表达也受到了研究者的重视。

Aiad等^[20]和Pujani等^[21]研究显示：PTC组织中Ki-67的增殖指数较甲状腺良性肿瘤明显升高，这对鉴别甲状腺结节的良恶性具有重要意义，且增殖指数与被膜浸润、淋巴结转移呈正相关关系，但以Ki-67增殖指数区分良、恶性肿瘤的临界值尚未明确。Song等^[22]研究显示：Ki-67在良性甲状腺疾病(结节性甲状腺肿或滤泡腺瘤)中阳性率为37.09%，在PTC中的阳性率为40.59%，2组阳性率比较差异无统计学意义，因此Ki-67阳性率无确切的诊断价值。有学者^[23]认为：Ki-67在鉴别滤泡性腺瘤和滤泡性癌方面有重要的诊断价值，Ki-67在正常组织中无阳性表达，但在良性病变、乳头状癌和滤泡癌组织中表达水平升高，在滤泡癌组织中最高，组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)，可作为提示恶性增生浸润趋势的指标。

1.3 Ki-67表达水平评估PTC预后的价值

作为细胞增殖的标记物，Ki-67表达水平同样影响恶性肿瘤的临床疗效和预后。Pujani等^[21]研究显示：Ki-67阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和组织类型无关联，而与淋巴结转移和TNM分期有关联，Ki-67表达水平的变化可作为临床评价PTC的侵袭性和判定预后的参考指标。研究^[9]显示：Ki-67的阳性表达虽然与PTC患者病理分期、转移和肿瘤大小均无关联，但其表达率随肿瘤侵袭性的升高呈逐步上升趋势，因而认为Ki-67是判定PTC侵袭性的标记物。研究^[23]显示：与多个肿瘤增殖标志物比较，Ki-67阳性PTC患者的复发风险较高，生存率降低，Ki-67表达水平与PTC的复发和预后密切关联。虽然Ki-67对PTC的预后有提示作用，但是因为PTC分化程度较高，恶性程度较低，有一定数量的肿瘤细胞处于增殖静止期，因此关于Ki-67能否作为PTC诊疗效果的监测指标尚存在争议。

2 BRAF基因突变 2.1 BRAF基因的结构、功能和BRAF基因突变的致癌机制

BRAF属RAF基因家族，位于人染色体7q34。编码的蛋白酶属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶参与调节细胞的增殖、分化和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路(即MAPK信号通路)的传导。BRAF ^V600E基因突变导致表达的蛋白质产物中第600位的缬氨酸被谷氨酸替代(命名为V600E)，该易位致使BRAF持续性激活，从而持续性激活ERK/MAPK，进而引发肿瘤。BRAF^V600E基因突变是PTC中最常见的突变类型，约占整个BRAF基因突变类型的90%^[24]。

细胞周期调控的异常大多发生在G₀/S期，这个过程涉及MAPK信号通路在内的多个通路异常，从而导致抑癌基因和原癌基因等表达的蛋白在细胞核内堆积，最终引起细胞无序增殖。体内MAPK通路的正常激活可调节细胞的生理活动，该激活通路中蛋白或激酶的异常活化均可引起MAPK信号通路的持续激活，进而导致细胞的异常增殖和肿瘤的形成。RAF蛋白有3种，即ARAF、BRAF和CRAF。其中BRAF蛋白单独结合到Ras后即可被激活，是MAPK信号通路中最常见、最强的激活剂。

PTC的BRAF^V600E基因突变可能与金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)、视黄酸受体β2(RARβ2)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)和DNA修复基因(特别是hMLH1基因)等肿瘤抑制基因的甲基化关系密切，这些肿瘤抑制基因的沉默在诱发BRAF突变及形成PTC侵袭性的过程中起重要的作用。研究^[25]显示:BRAF^V600E基因突变与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的过度表达、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)的突变密切相关，VEGF与EGFR的过量表达通过多种途径共同参与肿瘤血管的生成过程，在PTC的形成、发展与转移中发挥重要作用。

2.2 BRAFV600E基因突变与PTC侵袭性的关系

BRAF^V600E基因突变诱导ERK1/2磷酸化，该信号通路的持续激活与PTC发生、摄碘能力下降及去分化有关^[26]。研究^[27]证实：BRAF^V600E基因突变可通过诱导PTC细胞转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)抑制钠碘同向转运体(sodium iodide symporter, NIS)的表达及其在质膜的正确定位，BRAF^V600E基因突变能增加抑制素的过量分泌和诱导TGF-β分泌，抑制素能调节BRAF突变促进PTC形成，而TGF-β能抑制NIS的表达及其在质膜上的正确定位，降低PTC肿瘤细胞摄碘能力，增加患甲状腺癌的危险，影响PTC患者的预后。Smad7在转录水平上可抑制BRAF^V600E基因突变的PTC细胞中NIS的表达。上述2种机制既相互独立又相互合作。Xing等^[28]认为：BRAF^V600E基因突变通过调控NIS和促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor，TSHR)基因的甲基化致其沉默，致后者表达水平降低或不表达，从而导致PTC的摄碘能力下降或缺失，对¹³¹I治疗不敏感，使肿瘤去分化，侵袭性增加。

通常情况下，在PTC分化较好的区域较分化较差的区域更易于检测到BRAF^V600E基因突变。在PTC、乳头状癌起源的低分化癌和未分化癌的某些具有乳头状结构的区域中能够检测到BRAF^V600E基因突变，而在髓样癌及滤泡癌等其他甲状腺恶性肿瘤和良性病变以及正常的甲状腺组织中均未被发现，说明PTC可以演变成低分化癌和未分化癌，提示BRAF^V600E基因突变可能是促使肿瘤形成、促使癌细胞向低分化方向转变的重要因素。LiF等^[29]的研究结果显示：BRAF^V600E基因突变与PTC的腺体包膜外浸润、淋巴结转移和肿瘤高TNM分期密切相关，可使其具有更高的包膜侵袭率。

2.4 BRAF^V600E基因突变对PTC的诊断价值

在甲状腺癌中，BRAF^V600E基因突变的致癌作用已经在动物和细胞实验中得到证实，该基因突变可在体外诱导正常甲状腺滤泡上皮细胞向癌细胞转化，在转基因小鼠体内可诱导小鼠甲状腺BRAF蛋白的异常表达，从而促使小鼠PTC的形成。BRAF^V600E突变在PTC患者中发生率为29%~90%^[30-32], 导致各报道的突变率差异的原因尚未明确，可能与检测方法、患者种族不同和地域差异等有关。BRAF^V600E基因突变被认为是在PTC中最常见的遗传学事件，是一个特异性较高的诊断标志物，且在良性结节中并不存在。因此，对甲状腺结节进行细针穿刺细胞学检测(fine needle aspiration cytology，FNA)配合BRAF^V600E基因突变的检测有助于PTC的早期诊断及甲状腺良、恶性结节的鉴别。Adeniran等^[33]对157例甲状腺结节患者进行FNA和BRAF^V600E基因突变检测发现：单纯FNA检测对PTC诊断的灵敏度仅为63.3%，与BRAF基因突变联合检测则可将灵敏度提升至80%。

2.5 BRAF^V600E基因突变对PTC治疗和预后的影响

目前，手术治疗是PTC的主要治疗方式。尽管PTC的病程进展缓慢，预后较好，但仍有约10%的死亡率。BRAF^V600E基因突变PTC患者的复发和死亡率均较未突变者高，提示BRAF^V600E基因突变是影响PTC患者预后的独立因素^{[10, 34]}。BRAF^V600E基因突变检测有助于临床治疗方案的制订和预后的判断，更有助于在细胞形态学不典型和取样不佳的情况下做出比较有效的诊断，对明确肿瘤的性质具有重要意义^[34-35]。

BRAF^V600E基因突变阴性的患者因其对放射性碘有高度的敏感性，若存在淋巴结微转移，也可不行淋巴结清扫，而是在全切手术后给予放射性碘治疗，同样可达到有效治愈的目的。高危PTC患者行放射性碘治疗预防复发及死亡的作用已经得到认可，然而对于低危患者，其作用尚未达成共识，而且放射性碘治疗还有引起其他癌症发生的可能。对于低危PTC患者，单纯的病理学检查不能预测其术后复发和死亡率，而BRAF检测阳性者有更高的复发及死亡率，所以即使是低危患者术后给予适量的放射性碘治疗也是必要的。因考虑到BRAF阳性者摄碘功能受损，术后应给予更高剂量的放射性碘治疗和更低剂量的促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)抑制，降低这类PTC患者的复发及死亡风险。近些年，甲状腺癌治疗的研究热点已转向由BRAF基因为靶点的分子生物学治疗，该治疗方法可使用某种靶向药物特异性抑制BRAF突变导致的MAPK通路异常激活。尤其对于手术无法切除、无法耐受手术或对放射性碘治疗无效的患者，靶向治疗可能成为一种新的治疗途径^[36]。目前常见的BRAF抑制剂有ALL881和LBT613，其临床疗效有待进一步研究。

综上所述，Ki-67和BRAF^V600E基因突变与PTC细胞增殖和侵袭性有关联，可作为鉴别诊断肿瘤良恶性、临床分期及判断预后的敏感指标。目前，两者联合检测对PTC的术前诊断有一定的作用，但两者的相关性未见明确报道，有待进一步研究，二者联合检测在临床中的应用值得继续探索。