生长激素释放激素受体(growth hormone-releasing hormone receptor, GHRHR)是G蛋白偶联受体第二家族成员，GHRHR只存在于垂体和极少数垂体外正常组织中。在垂体前叶，GHRHR可与生长激素释放激素(GHRH)特异性结合，激活下游信号通路，释放生长激素，从而促进细胞的生长^[1]。研究^[2-5]显示:GHRHR的剪接变异体广泛存在于不同类型的肿瘤组织和癌细胞系中，其中，生长激素释放激素受体剪接变异体1(growth hormone-releasing hormone receptor splice variant 1, GHRHR-SV1)的存在最广泛，且其结构与垂体型GHRHR最相似，仅氨基端胞外区的25个氨基酸序列替代了垂体型GHRHR的89个氨基酸序列^[6-7]，其能与GHRH结合，调节GHRH的促细胞增殖作用^[8]。Barabutis等^[9]将垂体型GHRHR和GHRHR-SV1转染到本身无这2个基因的MCF-7细胞系中，结果显示：与垂体型GHRHR比较，GHRHR-SV1能更强有力地促进细胞的增殖，提示GHRHR-SV1在肿瘤的发生发展过程中可能发挥重要作用，因此，为了进一步研究GHRHR-SV1的功能，根据GHRHR-SV1胞外区特异性抗原决定簇序列，本研究构建原核表达载体pET-GHRHR-SV1, 表达并纯化GHRHR-SV1蛋白，将其免疫家兔，制备兔多克隆抗体，检测抗体效价，并利用其检测肿瘤细胞中SV1蛋白的表达情况，为后续的肿瘤细胞机制研究奠定实验基础。

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)和质粒pET-32a (+)保存于广州医科大学生化实验室，小鼠黑色素瘤细胞B16-F10购自美国ATCC细胞库。

新西兰雄性家兔2只，体质量为2 kg，购自广东省实验动物中心。限制性内切酶、DNA ligation kit、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和PCR试剂购自日本TaKaRa公司，凝胶回收和质粒提取试剂盒购自北京天根公司，His Bind Purification kit购自德国Novagen公司，HRP酶标羊抗兔二抗购自美国BD公司，ECL化学发光液购自上海碧云天公司。恒温摇床和恒温CO₂培养箱购自美国Thermo公司，PCR仪、凝胶成像系统和蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司，酶标仪Sunrise-Basie购自奥地利Tecan公司。

设计GHRHR-SV1基因序列如下：5′-GGATCCATGGTTCCGGGCACCCCGTCTCC-TCTGCTGGGTCGTGGTAAAGAACTGTGGCT-GGAGTCCCTGGCGGCTCTGCCATACTGCCT-CGAG-3′，将该基因送往上海生工合成并将其连接于克隆载体PUC57，质粒命名为PUC-SV1。利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对质粒PUC-SV1和pET-32a (+)进行双酶切，反应产物经1.5%凝胶电泳鉴定, 确定大小正确后回收。采用T4连接酶将GHRHR-SV1和pET-32a (+)连接，将连接产物转化入感受态细胞DH5α中，重组菌采用pET-32a (+)通用引物进行菌落PCR及电泳鉴定，如果相应孔道318 bp处出现条带，则该重组菌为阳性克隆，将其送往公司测序。

将pET-GHRHR-SV1转化入感受态细胞BL21中，经菌液PCR鉴定后，将其转入LB液体培养基中，摇菌至吸光度(A)值约为0.8。

分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L^-1 IPTG于37℃诱导表达蛋白4 h，SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝染色，根据目的条带颜色的深浅来检测蛋白的表达量。

加入1.0 mmol·L^-1IPTG，于37℃诱导1、2、4和6 h后，SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝染色，根据目的条带颜色的深浅检测蛋白的表达量。

加入1.0 mmol·L^-1 IPTG，分别在37℃、30℃和25℃下诱导4 h，SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝染色，根据目的条带颜色的深浅来检测蛋白的表达量。

诱导蛋白表达后，收集菌体，分别冰浴超声20 min和1 h，超声结束后离心，取2组(20 min组和1h组)的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝染色，根据目的条带颜色的深浅来检测蛋白的表达量。

通过可溶性分析可知蛋白以可溶形式存在，将超声破碎后所得的上清用滤膜过滤；将His·Bind树脂加入空色谱柱后，清洗、离子化和平衡色谱柱，再加入制备好的抽提物，流速为每小时10倍床体积，加入结合缓冲液，再加入漂洗缓冲液，最后加入洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，洗脱液分段收集，将收集的洗脱液、空载体表达产物和纯化前的重组载体表达产物进行SDS-PAGE电泳后染色，在凝胶成像仪上扫描并进行灰度分析，计算目的条带灰度占总条带灰度的比例，从而获得蛋白的纯度。

选取雄性家兔，抽取免疫前的血清作为阴性对照，背部多点皮下注射纯化后的蛋白，首次免疫量为1 mg，以后免疫用量为500 μg，加强免疫4次，第4次加强免疫1周后颈动脉放血收集多抗血清。首先用棋盘滴定法确定抗原抗体的最佳反应浓度，再用最佳蛋白浓度包被96孔板，4℃包被过夜，PBST洗板3次，用牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2 h，洗板。加入不同稀释度的兔多抗作为一抗，并将免疫前血清设为阴性对照，将PBS设为空白对照。加入HRP酶标羊抗兔二抗(1:5 000)，37℃孵育1 h，洗板。加入TMB显色底物，显色5~20 min，待显色满意后加入等体积2 mmol·L^-1 H₂SO₄终止反应，用酶标仪检测A (450)值，兔多抗与阴性血清A值的比值大于2.1即判为阳性。

采用Western blotting法检测细胞中GHRHR-SV1蛋白的表达，RIPA裂解液裂解细胞后，将裂解物进行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，用含5%BSA的TBST封闭膜2 h, TBST洗膜3次, 加入封闭液稀释的兔多抗(1:1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入封闭液稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(1:5 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，将膜用ECL化学发光，检测是否出现相对分子质量约为39 500的目的条带，如果出现则表示B16-F10细胞表达GHRHR-SV1蛋白。

质粒PUC-SV1和pET-32a (+)经双酶切后进行凝胶电泳鉴定，GHRHR-SV1基因大小约为91 bp，pET-32a (+)质粒大小约为5 860 bp，与预期结果一致(图 1A)。PCR法鉴定结果显示：阳性克隆可扩增出长度约为318 bp的目的条带(图 1B); 测序结果表明：GHRHR-SV1基因成功插入pET32a (+)中，并且三联密码子阅读框正确，成功构建了原核表达载体pET-GHRHR-SV1(图 1C)。

A: Electrophoregram of PUC-SV1 and pET-32a (+) (M: DNA marker; SV1:Target gene; PET32a: Linearized plasmid); B:PCR identification (M: DNA marker; Lane 1:Control; Lane 2-3:PCR product of recombinant plasmid); C: DNA sequencing diagram. 图 1 原核表达载体pET-GHRHR-SV1的构建和鉴定 Figure 1 Construction and identification of prokaryotic expression vector pET-GHRHR-SV1

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pET-32a (+)表达产物相对分子质量约为21 000，重组载体表达产物相对分子质量约为24 000。SDS-PAGE电泳结果表明：IPTG可诱导目的蛋白的表达，当IPTG浓度为2 mmol·L^-1时，目的蛋白的表达量最高(图 2A)；IPTG诱导蛋白表达2 h，蛋白表达量明显比1 h高，但超过2 h, 蛋白表达量无明显变化(图 2B)。当温度为25℃时，IPTG诱导重组菌表达目的蛋白量最大(图 2C)。

A: Different dosages of IPTG (M: Protein molecular weight marker; Lane 1:Non-recombinant vector; Lane 2-6: 0, 0.5, 1.0, 1.5, and 2.0 mmol·L-1 IPTG); B: Different time (M: Protein molecular weight marker; Lane 1:Non-recombinant vector; Lane 2-5: 1, 2, 4, and 6 h); C: Different temperatures (M: Protein molecular weight marker; Lane 1:Non-recombinant vector; Lane 2-4:37℃, 30℃, and 25℃). 图 2 不同条件下GHRHR-SV1蛋白表达量电泳图 Figure 2 Electrophoregram of expressionamounts of GHRHR-SV1 protein under different conditions

图选项

超声破碎1 h后, 目的蛋白在上清中的表达量比沉淀中多，提示目的蛋白主要以可溶形式存在(图 3A)。经His-Bind亲和层析柱纯化后，SDS-PAGE电泳结果显示：纯化的重组蛋白相对分子质量约为24 000，与预期相符，蛋白纯度约为80%(图 3B)。

A: Soluble form of GHRHR-SV1 protein (M: Protein molecular weight marker; Lane 1: Non-recombinant vector; Lane 2-3: Supernatant and precipitation at 20 min; Lane 4-5: Supernatant and precipitation at 1 h); B: Purification (M: Protein molecular weight marker; Lane 1: Non-recombinant vector; Lane 2-3:Purified fusion protein; Lane 4: Protein before purification). 图 3 GHRHR-SV1蛋白的可溶性分析和纯化电泳图 Figure 3 Electrophoregram of dissolved analysis and purification of GHRHR-SV1 protein

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GHRHR-SV1蛋白包被量为1.25 ng时，抗原抗体反应的线性关系较好。采用最佳蛋白浓度包被96孔板，不同稀释度的兔多抗作为一抗，出现阳性的抗体最高稀释度(即抗体效价)为1:1 600 000。见图 4和表 1。

图 4 ELISA法确定最佳抗原浓度 Figure 4 Optimal concentration of antigen tested by ELISA method

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Western blotting法检测结果显示：在蛋白相对分子质量约为39 500处可见明显的条带，表明B16-F10细胞表达GHRHR-SV1蛋白(图 5)。

Lane 1, 2:GHRHR-SV1 protein. 图 5 Western blotting法检测B16-F10细胞中GHRHR-SV1蛋白表达 Figure 5 Expressions of GHRHR-SV1 protein in B16-F10 cells detected by Western blotting method

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GHRHR只存在于垂体和极少数垂体外正常组织中，但目前研究表明GHRHR-SV1在多种肿瘤细胞中表达，Mezey等^[10]发现GHRHR-SV1在人的恶性胶质瘤组织中表达；Fahrenholtz等^[11]发现GHRHR-SV1在各种前列腺细胞系中高度表达。研究^[12]显示：GHRHR-SV1主要是通过介导GHRH来促进细胞的增殖，从而参与肿瘤的发生发展过程。Kiaris等^[13]研究发现：GHRHR-SV1在无GHRH参与的条件下也能促进细胞的增殖，但具体通过何种途径来发挥作用尚未阐明，有待进一步的研究。以SV1为靶点，开发新型抗肿瘤药物将是肿瘤防治研究的重要方向^[14-15]，本文作者推测采用SV1特异性抗体封闭GHRHR-SV1的作用可能也是拮抗肿瘤细胞增殖的有效手段。

GHRHR-SV1蛋白氨基端胞外区的25个氨基酸序列与垂体型GHRHR不同，本研究针对这25个氨基酸序列设计半抗原，根据半抗原氨基酸序列预算表达蛋白的相对分子质量约为3 000，属于相对分子质量较小的蛋白，不利于发挥免疫原性，为了加强免疫性并促进蛋白的稳定表达，将半抗原基因克隆至表达载体上，与载体自身包含的基因以融合蛋白的形式表达，得到相对分子质量约为24 000的融合蛋白。选用IDA His Bind树脂进行纯化，His-Tag组氨酸中咪唑基与Ni²⁺的螯合, 使蛋白得到纯化。多次多点免疫家兔制备兔多克隆抗体，ELISA法检测结果表明该抗体效价高，为1:1 600 000；采用ExPASy Molecular Biology Server软件预测细胞中GHRHR-SV1蛋白相对分子质量为39 500，采用该抗体检测出黑色素瘤细胞B16-F10表达GHRHR-SV1蛋白。本研究结果进一步验证了GHRHR-SV1蛋白在肿瘤细胞中的表达，为后续的抗肿瘤研究奠定了基础。

在后续的实验研究中，本课题组将采用该抗体进一步验证GHRHR-SV1在各种类型肿瘤细胞中的表达，并探究其对肿瘤细胞增殖的拮抗作用以及相关机制。