吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (06): 1163-1167

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和秀魁, 陶莉莉, 袁晓兰, 齐一鸣, 罗喜平, 潘碧琦
HE Xiukui, TAO Lili, YUAN Xiaolan, QI Yiming, LUO Xiping, PAN Biqi
可溶性Tim-3对原因不明性复发性流产患者Th1/Th2分化的免疫调节作用及其机制
Immunoregulatory effectof soluble Tim-3 on Th1/Th2 differentiation in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion and its mechanism
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1163-1167
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(06): 1163-1167
10.13481/j.1671-587x.20160622

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收稿日期: 2015-03-04
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和秀魁, 陶莉莉, 袁晓兰, 齐一鸣, 罗喜平, 潘碧琦. 可溶性Tim-3对原因不明性复发性流产患者Th1/Th2分化的免疫调节作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1163-1167.
HE Xiukui, TAO Lili, YUAN Xiaolan, QI Yiming, LUO Xiping, PAN Biqi. Immunoregulatory effectof soluble Tim-3 on Th1/Th2 differentiation in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion and its mechanism[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(06): 1163-1167.
可溶性Tim-3对原因不明性复发性流产患者Th1/Th2分化的免疫调节作用及其机制
和秀魁1,2, 陶莉莉1, 袁晓兰2, 齐一鸣2, 罗喜平2, 潘碧琦3     
1. 广州中医药大学第一临床医学院妇科, 广东 广州 510405;
2. 广东省妇幼保健院 广州医学院附属广东省妇儿医院妇产科, 广东 广州 511442;
3. 广东省妇幼保健院 广州医学院附属广东省妇儿医院中医科, 广东 广州 511442
收稿日期: 2015-03-04
基金项目: 广东省中医药局科研项目资助课题（20152022）
作者简介: 和秀魁(1973-), 女, 广东省信宜市人, 主任医师, 医学博士, 主要从事妇科内分泌、普通妇科和中西医结合妇科方面的研究。
通信作者: 陶莉莉, 教授, 主任医师, 博士研究生导师(Tel:020-36591360, E-mail:2762204682@qq.com)
[摘要]: 目的: 观察可溶性T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（sTim-3）在原因不明性复发性流产（URSA）患者血清中表达水平的变化及其对Th1/Th2细胞分化的调节，探讨sTim-3在URSA病理过程中的免疫机制。 方法: 选择52例URSA患者作为URSA组，选取同期正常妊娠孕妇20人作为正常妊娠组，育龄非孕者20人为健康对照组。采用ELISA法检测3组研究对象血清sTim-3和半乳糖结合蛋白9（Galectin-9）水平；双抗体夹心ELISA法检测血清中Th1型细胞因子干扰素γ（IFN-γ）和白细胞价素2（IL-2）、Th2型细胞因子IL-4和IL-10水平。 结果: 与健康对照组比较，URSA组患者血清sTim-3（t=7.34，P < 0.05）及Galectin-9水平（t=4.86，P < 0.05）均升高；URSA组患者血清sTim-3水平明显高于正常妊娠组（t=5.63，P < 0.05），而Galectin-9水平则低于正常妊娠组（t=2.76，P < 0.05）。正常妊娠组（t=2.81，P < 0.05；t=2.84，P < 0.05）和URSA组（t=3.66，P < 0.05；t=2.91，P < 0.05）研究对象血清IFN-γ及IL-2水平低于健康对照组；URSA组患者血清IFN-γ和IL-2水平明显高于正常妊娠组（t=6.11，P < 0.05；t=5.95，P < 0.05）。与健康对照组比较，正常妊娠组和URSA组研究对象血清IL-4和IL-10水平升高（t=2.53，P < 0.05；t=2.52，P < 0.05；t=2.69，P < 0.05；t=2.33，P < 0.05）；URSA组患者血清IL-4和IL-10水平明显低于正常妊娠组（t=6.48，P < 0.05；t=7.76，P < 0.05）。 结论: sTim-3表达增加和Th1/Th2稳态调节失衡可能是导致URSA患者反复流产的关键免疫机制之一。
关键词： 原因不明性复发性流产     可溶性Tim-3     Th1/Th2    
Immunoregulatory effectof soluble Tim-3 on Th1/Th2 differentiation in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion and its mechanism
HE Xiukui1,2, TAO Lili1, YUAN Xiaolan2, QI Yiming2, LUO Xiping2, PAN Biqi3     
1. Department of Gynecology, First Clinical Hospital, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China;
2. Department of Gynecology, Guangdong Women and Child Hospital, Guangdong Provincial Maternity and Child Care Center, Guangzhou Medical College, Guangzhou 511442, China;
3. Department of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Women and Child Hospital, Guangdong Provincial Maternity and Child Care Center, Guangzhou Medical College, Guangzhou 511442, China
[Abstract]: Objective: To observe the changes of expression levels of serum soluble Tim-3(sTim-3) and its regulation effect on Th1/Th2 differentiaton in the patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA), and to investigate the possible immunmechanism of sTim-3 in the pathological process of URSA. Methods: A total of 52 patients with URSA were regarded as URSA group, and 20 normal pregnancy women at the same period were selected as normal pregnancy group and 20 non-pregnancy women in gestation age were selected as healthy control group.ELISA method was used to detect the levels of serum sTim-3 and galactose binding protein 9(Galectin-9) and the levels of serum Th1 cytokines interferonI-γ(IFN-γ) and IL-2 and Th2 cytokines IL-4 and IL-10 of the subjects in three groups. Results: Compared with healthy control group, the levels of serum sTim-3(t=7.34, P < 0.05) and Galectin-9 (t=4.86, P < 0.05) of the patients in URSA group were increased. The level of serum sTim-3 of the patients in URSA group was significantly higher than that in normal control group (t=5.63, P < 0.05), but the level of serum Galectin-9 of the pathents in URSA group was lower than that in normal control group (t=2.76, P < 0.05).The levels of serum IFN-γ and IL-2 of the subjects in normal control group (t=2.81, P < 0.05;t=2.84, P < 0.05) and URSA group (t=3.66, P < 0.05;t=2.91, P < 0.05) were lower than those in healthy control group.The levels of serum IFN-γ and IL-2 of the patients in URSA group were higher than those in normal control group (t=6.11, P < 0.05;t=5.95, P < 0.05).The levels of serum IL-4 and IL-10 of all the subjects in normal pregnancy group and URSA group were higher than those in healthy control group (t=2.53, P < 0.05;t=2.52, P < 0.05;t=2.69, P < 0.05;t=2.33, P < 0.05); the IL-4 and IL-10 levels of the patients in URSA group were lower than those in normal control group (t=6.48, P < 0.05;t=7.76, P < 0.05). Conclusion: The increased expression of sTim-3 and the imbalance of Th1/Th2 homeostasis may be one of the key immunomechanisms of inducing recurrent abortion in the URSA patients.
Key words: unexplained recurrent spontaneous abortion     soluble Tim-3     Th1/Th2    

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指连续发生2次或2次以上的自然流产，其病因包括胚胎染色体异常、感染、解剖学异常、内分泌紊乱、免疫系统疾病和社会心理因素等[1]。虽然有学者[1]认为可采用发生连续3次或3次以上的自然流产作为RSA的诊断标准，但连续发生2次自然流产后，再次妊娠的流产率高达50%以上，与3次流产者相近，故提出将连续发生2次的自然流产者纳入RSA的范畴，以引起足够的重视。50%以上RSA的原因不明，称为原因不明性复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]，其中部分可能与母体免疫耐受有关联。近年来，母体免疫耐受调节成为揭示URSA致病机制的热点方向，研究[3]已证实Th1/Th2稳态在正常妊娠中发挥关键作用。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin mucin 3，Tim-3)是新近发现的一种T细胞负性调节共刺激分子，在巨噬细胞的活化调节和细胞免疫应答、维持Th1/Th2的平衡、免疫耐受及自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用[4]。可溶性Tim-3(soluble Tim-3，sTim-3)是由Tim基因编码的可溶性产物，与Tim有着相同的免疫识别区域，正常人血清中几乎检测不到，但病理状态下sTim-3水平却明显升高，有重要的临床意义[5]。目前，关于sTim-3是否参与了URSA的发病，国内尚无相关的文献报道。本研究对比URSA患者体内sTim-3和Th1/Th2型细胞因子的水平变化，旨在为URSA的临床免疫治疗探索新的靶点。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选取2014年5月-2015年1月在广东省妇幼保健院妇科就诊的52例URSA患者作为USRA组，年龄20~35岁，平均年龄(25.51±3.45)岁，体质量指数(BMI)为(24.39±4.65) kg·m-2。纳入标准：年龄18~40岁且临床诊断为URSA的患者。URSA的诊断标准按照乐杰主编的第7版《妇产科学》[6]，即连续发生2次及2次以上的自然流产。排除标准：夫妻双方染色体核型异常、男方精液常规异常者、有生殖道畸形或感染者、自身抗体任意一项阳性者、血小板增多者、低纤维蛋白血症者和内分泌紊乱者。同时随机连续选取同期于该院行常规产检的孕7~12周孕妇20人作为正常妊娠组，排除有不良生育史、近期服用激素类药物、肿瘤等其他慢性疾病、死胎和宫外孕者。另外选取育龄非孕者20人作为健康对照组，排除既往有自然流产史者。3组研究对象的年龄、BMI等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 样本采集

晨起采集空腹静脉血5mL于ST550C促凝管中，3组研究对象的全血标本轻轻混匀后静置20min。3000 r·min-1离心15 min，分离上清，-80℃储存备用。

1.3 检测方法

双抗体夹心ELISA法检测3组研究对象血清sTim-3和半乳糖结合蛋白9(galactose binding protein 9，Galectin-9)水平，试剂盒分别为贝茵莱生物科技公司的Human-sTim3 ELISA Kit (DGE12386)和Human-Galectin-9 ELISAKit (DGE12384)；Th1型细胞因子[干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)和白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)]及Th2型细胞因子[白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)和白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)]水平检测采用的ELISA试剂盒购于深圳晶美生物有限公司。实验严格按照试剂盒说明书进行操作，采用自动酶标仪bio-tek elx808读取450nm处的吸光度(A)值，软件绘制标准曲线，计算sTim-3和Galectin-9水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。3组研究对象的年龄、BMI和sTim-3、Galectin-9、IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10水平以x±s表示，3组研究对象血清sTim-3和Galectin-9、IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果 2.1 3组研究对象血清sTim-3和Galectin-9水平

URSA组患者血清sTim-3水平高于健康对照组和正常妊娠组(t=7.34，P < 0.05；t=5.63，P < 0.05)；正常妊娠组和URSA组研究对象血清Galectin-9水平高于健康对照组(t=6.11，P < 0.05；t=4.86，P < 0.05)，URSA组患者血清Galectin-9水平低于正常妊娠组(t=2.76，P < 0.05)。见表 1。

表 1 3组研究对象血清sTim-3和Galectin-9水平 Table 1 Levels of serum sTim-3 and Galectin-9 of subjects in three groups
[x±s, ρB/(ng·L-1)]
Group n sTim-3 Galectin-9
Healthy control 20 289.22±121.57 442.20±123.25
Normal pregnancy 20 356.30±108.18* 745.29±184.37*
URSA 52 514.88±103.52*△ 618.74±147.31*△
*P < 0.05 compared withhealthy control group; △P < 0.05 compared withnormal pregnancy group.
表选项
2.2 3组研究对象血清IFN-γ和IL-2水平

与健康对照组比较，正常妊娠组研究对象血清IFN-γ和IL-2水平明显降低(t=2.81，P < 0.05；t=2.84，P < 0.05)。URSA组患者血清IFN-γ和IL-2水平明显高于正常妊娠组(t=6.11，P < 0.05；t=5.95，P < 0.05)和健康对照组(t=3.66，P < 0.05；t=2.91，P < 0.05)。见表 2。

表 2 3组研究对象血清IFN-γ和IL-2水平 Table 2 Levels of serumIFN-γ and IL-2 of subjects in three groups
[x±s, ρB/(ng·L-1)]
Group n IFN-γ IL-2
Healthy control 20 468.54±130.29 12.98±2.95
Normal pregnancy 20 351.65±133.22* 10.14±3.36*
URSA 52 584.33±171.45*△ 15.26±3.04*△
*P < 0.05 compared with healthy control group; △P < 0.05 compared with normal pregnancy group.
表选项
2.3 3组研究对象血清IL-4和IL-10水平

正常妊娠组和URSA组研究对象血清IL-4和IL-10水平均高于健康对照组(t=2.53，P < 0.05；t=2.52，P < 0.05；t=2.69，P < 0.05；t=2.33，P < 0.05)。URSA组患者血清IL-4和IL-10水平低于正常妊娠组(t=6.48, P < 0.05;t=7.76，P < 0.05)。见表 3。

表 3 3组研究对象血清IL-4和IL-10水平 Table 3 Levels of serum IL-4 and IL-10 of subjects in three groups
[x±s, ρB/(ng·L-1)]
Group n IL-4 IL-10
Healthy control 20 10.24±2.98 11.53±3.22
Normal pregnancy 20 17.25±3.13* 20.69±3.49*
URSA 52 12.16±2.59*△ 13.77±3.78*△
*P < 0.05 compared with healthy control group; △P < 0.05 compared with normal pregnancy group.
表选项
3 讨论

胎儿组织一半来源于父亲，因此对母体而言胚胎相当于一个同种半异体移植物，正常妊娠时，母体免疫系统通过识别、应答和负调控等一系列复杂的反应形成局部对胎儿免疫耐受的微环境。研究[3]证实:URSA的发生与免疫微环境稳态的失衡密切相关，而T细胞的活化与抑制是调节免疫稳态的关键节点。

近年来，作为重要的免疫调节分子家族，Tim家族在肿瘤、血液病、炎性疾病和自身免疫性疾病等疾病中的免疫调节作用得到广泛关注[5]，其中Tim-3是一种新近发现的T细胞负性共刺激分子，其有2种存在形式，一种是具有IgⅤ区、信号肽、跨膜区、黏液区和胞质区的全长膜型Tim3(full-length membrane-anchored form, flTim-3)，特异性表达于Th1细胞表面；另一种为因缺少跨膜区及黏液区而游离于血清中的sTim-3[7]。Galectin-9是目前已知的Tim-3唯一天然配体，属于β凝血因子家族，是一种广泛存在于细胞膜表面的可溶性糖蛋白，参与多种生命功能活动的调节，不仅可以诱导外周血和胸腺中的T细胞凋亡，还可直接下调IL-12的分泌[8]，而IL-12是诱导Th0向Th1细胞分化的关键因子[9]。因此，Galectin-9可以在过度免疫应答的情况下介导免疫耐受的发生，维持Th1/Th2的平衡。Tim-3与Galectin-9结合后可产生负向调节信号，由信号肽传至T细胞中，下调转录因子T-bet的表达[10]，进而抑制Th1细胞的分化和分泌[10]。

研究[11]表明：Tim-3在正常妊娠孕妇血清中的表达较未孕者明显升高，Tim-3/Galectin-9信号通路被激活，产生更多负性刺激信号，诱导Th1型细胞凋亡，使母胎界面的细胞免疫应答转为免疫抑制，减轻Th1型细胞因子对胎儿和滋养层细胞的损伤[11]。尽管sTim-3由Tim-3基因编码，并且与flTim-3有着相似的空间结构，但是在正常生理状态下却几乎检测不到，仅在疾病状态下其表达水平异常增加[5]。本研究采用更易操作的ELISA法检测正常孕妇和URSA患者血清中sTim-3水平。Lee等[12]认为：sTim-3与Tim-3具有相同的IgⅤ区，同时，可溶于水的特性使其分散性和活动性更强，易与相应配体结合而不受空间的限制，故其与Tim-3竞争结合Galectin-9时优势明显[12]。因此本文作者推测：当sTim-3大量占据了配体Galectin-9后，Tim-3对Th1细胞的抑制信号随即被阻断，Th1细胞激活，分泌大量IFN-γ、IL-2和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等，正常的母胎界面微环境改变，最终诱发流产。然而Dardalhon等[13]对sTim-3作用的观点却截然相反，认为体内因存在针对sTim-3的抗体而使免疫活动进一步遭到抑制，而非加强；Geng等[14]认为sTim-3可直接抑制Th1型细胞因子的分泌。本研究结果显示：URSA组患者血清sTim-3水平较健康对照组明显升高，较正常妊娠组也有所升高，这可能是由于母胎界面的免疫环境诱导Tim-3基因表达上调所致。正常妊娠组和URSA组研究对象血清Galectin-9水平均较健康对照组升高，但URSA组患者血清Galectin-9水平明显低于正常妊娠组，表明sTim-3在URSA中起免疫增强的作用。

Th1型细胞通过分泌IFN-γ和IL-2等介导细胞免疫，诱导活化NK细胞杀伤滋养层细胞、妨碍胚胎植入和胎盘生长发育[15]。而Th2型细胞则可分泌IL-4、IL-10和IL-6等，选择性抑制TNF-α、IL-2及集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子的合成，抑制免疫应答，降低巨噬、NK细胞的活性，降低淋巴毒素，介导同种排斥反应耐受[16]。正常妊娠情况下，为了对抗这种胎儿排斥反应，母体内环境由Th1型转为Th2型，IFN-γ和IL-2表达下调，IL-4和IL-10等抑制性因子表达水平升高，与本研究结果一致。URSA组患者Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2水平较正常妊娠组升高，Th2型细胞因子IL-10和IL-4水平则明显降低，Th1/Th2细胞比例发生失衡，再次向未孕状态倾斜，免疫应答增强。

sTim-3通过干扰Tim-3/Galectin-9转导通路，抑制Th1型细胞因子调控的负向信号，诱发Th0细胞向Th1而非Th2分化，改变了母胎界面的免疫微环境，从而导致反复流产。因此，有效控制患者体内sTim-3/Galectin-9水平有望成为URSA临床免疫治疗的新靶点。

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