肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其死亡率较高，化疗药物是治疗肺癌的主要药物。铂类药物是治疗肺癌的首选化疗药物，但该类药物的不良反应大，许多患者会产生耐药^[1]，寻找新的化疗药物一直是科研工作者共同努力的方向。没食子酸是一类多酚类化合物，广泛存在于红酒、绿茶和灵芝等多种食物中，且常以单体或鞣酸的形式存在^[2]。没食子酸单体可降低蛋白质的美拉德反应，延长食品的贮藏时间^[3]。除此之外，没食子酸还具有抗炎^[4]、抗过敏^[5]及抗病毒^[6]等功效，其中最引人注目的是没食子酸可以抑制肿瘤细胞的增殖。研究^[7-12]显示：没食子酸对多种实体瘤和非实体瘤的发生发展均有抑制作用，但具体机制有待进一步研究。没食子酸对肺癌细胞的增殖有抑制作用^[13]，其作用机制与促氧化作用有关联，但没食子酸对肺癌细胞A549中抗氧化酶的影响尚未见报道。本研究在体外研究没食子酸对肺癌细胞A549的毒性效应，并探讨其抑制肺癌细胞增殖的作用机制，为没食子酸抑制肺癌细胞增殖的研究奠定理论基础。

人非小细胞肺癌A549细胞株购于中国医学科学院肿瘤细胞库。没食子酸购于美国Sigma公司，胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素购于美国Gibco公司，RPMI-1640培养液购于美国Hyclone公司，台盼蓝、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜和瑞氏-姬姆萨复合染液购于北京索莱宝公司，Annexin Ⅴ-FITC染色液、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒和BCA蛋白浓度检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)购于南京建成生物制品研究所，β-actin、Fas和FasL蛋白以及HRP标记山羊抗兔IgG购于北京博奥森生物技术有限公司。HERAcell 150Ⅰ型二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司，Epoch take3型酶标仪购自美国BioTek公司，TI-EPFS型全电动完美对焦显微成像系统购自日本尼康公司，Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳槽和Mini Trans-Blot槽式转印系统购自美国伯乐公司，C6流式细胞仪购自美国BD公司。

人非小细胞肺癌A549细胞复苏后接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，取对数生长期细胞进行后续实验和检测。根据预实验结果选取对A549细胞抑制效果较好的3个没食子酸浓度(0、300、500和750 μmol·L^-1)作为低、中和高剂量组给药剂量，0μmol·L^-1没食子酸作为对照组剂量。

用胰蛋白酶消化处于对数生长期的A549细胞并离心收集，调节细胞密度至1×10⁵mL^-1接种于96孔板，每孔接种200 μL。待细胞贴壁后，按照上述分组加入没食子酸处理6、12和24 h，每个样品设6个复孔。处理结束后吸弃旧培养液，每孔加入200 μL不含血清的培养液，同时加入20 μL MTT，37℃孵育4 h后移除培养液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，在波长为490 nm条件下检测吸光度(A)值，计算不同处理时间各组细胞存活率。

A549细胞以2.5×10⁵ mL^-1密度接种于6孔板，每孔接种2 mL。待细胞贴壁后按照上述方法处理细胞，培养结束后移除培养液并用预冷的PBS缓冲液(1L溶液中含7.9 g NaCl、0.2 g KCl、0.24 g KH₂PO₄和1.8 g K₂HPO₄)洗涤3次，加入甲醇固定液固定细胞20 min，PBS缓冲液洗涤3次，再加入瑞氏-姬姆萨复合染液染色，PBS缓冲液洗涤3次，加入封片剂(甘油:水=9:1)防止干燥，在光镜下观察细胞形态表现，每组实验重复3次。

A549细胞以5 × 10⁵ mL^-1密度接种于6孔板，每孔接种2 mL单细胞悬浮液，置于37℃、5%CO₂培养箱继续培养24 h，吸弃旧培养液，加入用不含血清培养基稀释的药物继续干预处理24 h，同时设立加入等体积的不含血清的培养液作为空白对照组，继续培养24 h。用预冷的PBS缓冲液洗涤3次，胰蛋白酶消化后收集细胞，1 000 r·min^-1离心3 min，吸弃上清，加入预冷的PBS缓冲液洗涤2次，加入100 μLBinding buffer混匀，加入10 μLAnnexin Ⅴ-FITC染色液和10 μL PI染色液，混匀后孵育10 min，低速离心去上清，加入400 μLBinding buffer混匀，采用流式细胞术检测各组A549细胞的凋亡率。

各组A549细胞用没食子酸处理后，加入预冷的PBS缓冲液洗涤3次，每孔加入120 μLRIPA细胞裂解液，置于4℃冰箱中裂解30 min，待细胞充分裂解后，4℃、1 000 r·min^-1离心10 min，取上清进行蛋白定量，剩余上清以4:1比例与5×蛋白上样缓冲液充分混匀，沸水煮沸10 min以变性蛋白。变性后的蛋白提取液行SDS-PAGE电泳，电泳条件：浓缩胶浓度为5%，电压为100 V，分离胶浓度为12%，电压为120 V。湿转法将胶内蛋白转移到PVDF膜。转膜条件：300 mA、2 h。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入β-actin (1:600)、Fas或FasL一抗(1:400)稀释液，4℃冰箱孵育过夜，加入二抗稀释液(1:800稀释)，37℃孵育1 h。取出膜后洗涤3次，加入超敏ECL发光液并置于暗盒中压片，再将X光片置于定影液和显影液中显色。自来水清洗后晾干，扫描仪扫描成像，Image J软件对蛋白进行灰度分析。以β-actin作为对照，计算各组A549细胞中FasL和Fas蛋白的表达水平。蛋白表达水平=待测蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值^[14]。

按照1.5中方法接种A549细胞，加入没食子酸处理后收集6孔板中的细胞，用预冷的PBS缓冲液洗涤3次，胰蛋白酶消化后收集细胞，1 000 r·min^-1离心3 min，吸弃上清，按试剂盒说明书加入10 mmol·L^-1 DCFH-DA工作液1 mL (激发波长488 nm，发射波长525 nm)，37℃避光孵育30 min，预冷PBS缓冲液洗涤细胞3次，洗去未结合的染色液，加入200 μL预冷的PBS缓冲液并充分混匀细胞，采用流式细胞术检测A549细胞中ROS水平。

按照1.5中方法接种A549细胞，加入没食子酸处理后收集6孔板中的细胞，PBS缓冲液洗涤3次，加入蒸馏水低渗处理A549细胞30 min，充分裂解细胞后台盼蓝溶液检测细胞裂解程度，再低温离心收集上清。按照试剂盒说明书严格检测细胞中CAT、SOD和GSH-Px活性。

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。各组A549细胞存活率、凋亡率、FasL和Fas蛋白表达水平、ROS水平、CAT和SOD及GSH-Px活性均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析(LSD法)，组间两两比较采用SNK-q法检验。以α=0.05为检验水准。

对照组A549细胞存活率设为100%，没食子酸作用6 h后，低、中和高剂量没食子酸组A549细胞存活率分别为(97.68±2.29)%、(83.41±3.73)%和(70.96±2.06)%；没食子酸作用12 h后，低、中和高剂量没食子酸组A549细胞存活率分别为(95.67±3.45)%、(80.90±1.95)%和(62.47±5.59)%；没食子酸作用24 h后，低、中和高剂量没食子酸组A549细胞存活率分别为(92.75±2.01)%、(78.21±11.26)%和(55.37±4.19)%。与对照组比较，作用6 h，低剂量没食子酸组A549细胞存活率无明显变化(P>0.05)，中和高剂量没食子酸组A549细胞存活率明显降低(P < 0.05)；作用12和24 h后，各剂量没食子酸组A549细胞存活率明显低于对照组(P < 0.05)，细胞存活率的降低与作用时间和没食子酸剂量均呈依赖性关系。与6和12 h比较，作用24 h后，各剂量没食子酸组A549细胞存活率明显降低(P < 0.05)。

光镜下可见：对照组细胞形态规则，细胞大小基本一致，形态呈多边形，细胞与细胞之间连接紧密，细胞核与细胞质界限清晰，染色均匀，核仁呈深染且明显；与对照组比较，低剂量没食子酸组A549细胞数量减少，中和高剂量没食子酸组A549细胞数量减少的更加明显，且细胞与细胞之间的间隙增大，细胞排列稀疏且紊乱，多数细胞的细胞核与细胞质界限不清，细胞质皱缩，细胞体积变小、变圆，细胞呈明显凋亡特征。随着没食子酸剂量的增加，凋亡形态的细胞数量逐渐增多。见图 1(插页三)。

A:Control group; B-D:Low, middle, and high dosages of gallic acid groups. 图 1 各组A549细胞的形态表现(bar=100 μm) Figure 1 Morphology of A549 cells in various groups (bar=100 μm)

图选项

低、中和高剂量没食子酸组A549细胞凋亡率分别为(21.5±0.18)%、(27.5±0.30)%和(34.9±0.28)%，明显高于对照组(3.2%±0.21%)(P < 0.05)。高剂量没食子酸组A549细胞凋亡率明显高于低剂量没食子酸组(P < 0.05)；中剂量没食子酸组A549细胞凋亡率虽高于低剂量组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。中和高剂量没食子酸组A549细胞凋亡率组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着没食子酸剂量的增加，A549细胞凋亡率逐渐增加，呈剂量依赖关系。见图 2。

A:Control group; B-D:Low, middle, and high dosages of gallic acid groups. 图 2 流式细胞术检测各组A549细胞凋亡率 Figure 2 Apoptotic rates of A549 cells in various groups detected by FCM

图选项

Western blotting法检测，没食子酸作用于A549细胞后，低、中和高剂量没食子酸组FasL和Fas蛋白表达水平随着药物剂量的增加而呈明显升高的趋势，见图 3A。低和中剂量没食子酸组A549细胞中FasL和Fas蛋白表达水平虽高于对照组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量没食子酸组A549细胞中FasL和Fas蛋白表达水平明显高于对照组(P < 0.05)。各剂量没食子酸组A549细胞中FasL和Fas蛋白的表达呈正相关关系(r=0.92，P < 0.05)，FasL和Fas蛋白表达与没食子酸之间也呈剂量依赖关系，但低、中和高剂量没食子酸组A549细胞中FasL和Fas蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图 3B。

*P < 0.05 compared with control group. Lane 1: Control group; Lane 2-4: Low, middle, and high dosages of gallic acid groups. 图 3 各组A549细胞中Fas和FasL蛋白表达电泳图(A)和相对表达水平(B) Figure 3 Electrophoregram (A) and relative expressionlevels (B) of FasL and Fas proteins in A549 cells in various groups

图选项

低、中和高剂量没食子酸组A549细胞中ROS水平明显高于对照组(P < 0.05)；中剂量没食子酸组A549细胞中ROS水平虽高于低剂量没食子酸组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量没食子酸组A549细胞中ROS水平高于低剂量没食子酸组，且组间比较差异有统计学意义(P < 0.05)；高剂量没食子酸组A549细胞中ROS水平高于中剂量没食子酸组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图 4。

*P < 0.05 compared with control group; △P < 0.05 compared with low dosage of gallic acid group. 图 4 各组A549细胞中ROS水平直条图 Figure 4 Histogram of ROS levels in A549 cells in various groups

图选项

低、中和高剂量没食子酸组A549细胞中CAT活性虽高于对照组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，且CAT活性随没食子酸剂量增加而逐渐降低。低剂量没食子酸组A549细胞中SOD活性明显高于对照组(P < 0.05)；中和高剂量没食子酸组SOD活性虽高于对照组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；且SOD活性随没食子酸剂量增加而逐渐降低。低剂量没食子酸组A549细胞中GSH-Px活性高于对照组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；中和高剂量没食子酸组GSH-Px活性虽低于对照组，但组间比较差异也无统计学意义(P>0.05)；随着没食子酸剂量的不断增加，GSH-Px活性反而降低。低、中和高剂量没食子酸组间A549细胞中CAT、SOD和GSH-Px活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。

细胞凋亡是个体发育过程中严格受到调控的细胞正常死亡形式，其最终结果是细胞死亡，但细胞凋亡并非全都是自发的程序性死亡。当细胞受到外界环境影响后，也会启动细胞凋亡，这是许多抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞增殖的主要作用机制。本研究结果显示：随着处理时间的延长，A549细胞存活率也逐渐降低，没食子酸作用时间与细胞存活率之间存在时间依赖关系。各剂量组没食子酸作用24 h时细胞存活率明显低于6和12 h，该时点没食子酸的抑制效果最好。随着没食子酸剂量的增加，A549细胞存活率逐渐降低，且A549细胞呈现出细胞凋亡的形态学表现，具有凋亡特性细胞的比例明显升高，上述结果表明没食子酸对A549细胞增殖的抑制作用是通过诱导细胞凋亡的方式实现的。

Fas系统是目前研究的比较清楚的介导细胞凋亡的信号传导系统，王强等^[15]通过观察Fas和FasL在肺癌组织以及正常支气管黏膜上皮细胞中的表达发现：Fas和FasL在肺癌组织中的表达明显低于正常支气管黏膜上皮细胞，肺癌细胞能通过降低Fas和FasL的表达逃避机体的免疫监视，促进肺癌的发生和进展。本研究结果显示：随没食子酸的剂量的增加，Fas和FasL蛋白表达水平亦升高，Fas蛋白与细胞膜表面的Fas Ligand (FasL)配体相互识别后，肿瘤细胞被机体的免疫系统快速识别，进而触发肿瘤细胞的凋亡程序，启动细胞凋亡过程。没食子酸诱导细胞凋亡的能力随着其剂量增加而逐渐增强，细胞凋亡率与没食子剂量呈正相关关系。

没食子酸作用A549细胞后，细胞中ROS水平明显升高，ROS水平与没食子酸的剂量呈依赖关系。小剂量ROS是细胞分裂增殖所必需的，但大量ROS会造成细胞发生氧化损伤，进而激活细胞凋亡途径，使肿瘤细胞发生凋亡。因ROS大量生成所致的氧化损伤可能是没食子酸诱导A549细胞大量凋亡的重要作用机制之一。为了进一步验证ROS在没食子酸诱导A549细胞凋亡过程中的作用，本研究还检测了没食子酸作用后A549细胞中CAT、SOD和GSH-Px水平，该3种抗氧化酶主要参与清除活性氧自由基，降低ROS大量生成引起的氧化损伤以及脂质过氧化作用。肺癌细胞为了降低没食子酸所致的氧化损伤对自身产生的威胁，分泌了更多CAT、SOD和GSH-Px，此时肺癌细胞的抗氧化能力增强，没食子酸对细胞的毒性作用不强。当没食子酸剂量增加时，其所致的氧化损伤进一步加剧，细胞中的抗氧化酶系统不能拮抗这种严重的氧化损伤，酶活性被大量生成的活性氧抑制，因此酶活性降低，细胞存活率也明显降低。

综上所述，没食子酸对非小细胞肺癌A549细胞增殖有抑制作用，该抑制作用是通过诱导细胞凋亡的方式实现的，很好地扩展了没食子酸的抗肿瘤作用范围，且通过对ROS水平及抗氧化酶活性的检测，推测没食子酸是通过诱导细胞进一步发生氧化损伤作用并通过Fas/FasL信号通路来诱导细胞凋亡，其毒性作用可能与细胞中ROS的产生有关联。本研究结果为研究没食子酸抑制肺癌的作用机制提供了理论依据。