果蝇是生物学研究中的重要模型。果蝇S2细胞系来源于黑腹果蝇晚期胚胎细胞，是适用于重组蛋白表达的一种常用工具细胞系。Mu2最初是于雌性果蝇生殖细胞系中发现的影响DNA双链断裂过程的基因^[1-2]。Mu2基因突变造成卵细胞中DNA双链断裂处的修复率降低^[3]，其在体细胞中还具有细胞周期检查点功能^[4]。本研究对Mu2相互作用的蛋白进行筛选以明确Mu2蛋白的功能。本研究以Mu2为诱饵，分离并鉴定了5个可能的Mu2相互作用蛋白，提示Mu2可能参与DNA损伤之外的新功能，为进一步研究Mu2蛋白的新功能奠定实验基础。

果蝇S2细胞由中国医科大学盛京医院病理科保存。FLAG-Mu2表达质粒的构建：将Mu2 cDNA序列连接到N端带有FLAG标签的果蝇表达系统(购于美国Invitrogen公司)；Mu2 cDNA序列(Clone ID LD44171，购于美国OPEN biosystems公司)；构建的FLAG-Mu2质粒序列经测序验证正确^[5]。

Schneider’ s果蝇培养基购于美国Gibco公司，优级胎牛血清购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Lipofectamine²⁰⁰⁰脂质体转染试剂和核染料TOPRO-3购于美国Life Technologies公司，FLAG-M2琼脂糖珠购于美国Sigma公司，鼠源单克隆FLAG抗体购于上海睿星生物技术有限公司，cy-3标记驴抗鼠二抗购于美国Jackson Immuno Research公司，HRP标记羊抗鼠二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，核浆分离试剂盒及ECL发光底物购于美国Pierce公司，其他生化试剂为国产分析纯级别。Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳系统购于美国Bio-Rad公司，细胞超净工作台购于苏州安泰空气技术有限公司，共聚焦激光扫描显微镜购于日本Olympus公司。

S2细胞用含10%胎牛血清的Schneider’s果蝇培养基培养，添加100 U·mL^-1青霉素和100 U·mL^-1链霉素，于25℃无CO₂的培养箱中培养，待细胞生长状态良好时铺板进行转染。

转染工作液按转染说明书配置后，将其逐滴加入单层S2细胞中，轻柔摇晃混匀置于培养箱中孵育。6 h后弃去培养基，加入含血清培养基继续培养，48 h后进行后续实验。

细胞弃去培养基，加入4%多聚甲醛，室温固定15 min；PBS洗涤后，0.1%TritonX-100孵育10 min，进行透膜；加入驴血清室温封闭1 h；抗FLAG单克隆抗体(10 mg·L^-1)室温孵育1 h；PBS洗涤后，Cy3-驴抗鼠二抗(1 mg·L^-1)室温孵育1h；PBS洗涤后，TOPRO3室温孵育15 min；PBS洗涤后，采用60%甘油封片。采用共聚焦激光扫描显微镜观察Cy3标记的FLAG-Mu2蛋白和TOPRO染色的细胞核。

弃去培养基并用PBS清洗后，在培养皿中加入预冷的含蛋白酶抑制剂的TNE裂解液，用细胞刮将细胞缓慢挂下，并收集至离心管中；超声破碎细胞后，4℃、12 000 g离心15 min；取上清至新离心管中，作为细胞总蛋白。

根据NE-PER核浆分离试剂盒说明书进行浆蛋白和核蛋白的提取。胰酶消化细胞后，500 g离心5 min收集细胞；PBS洗涤后，加入预冷的细胞浆提取试剂Ⅰ，剧烈涡旋15 s后，冰上静置10 min；加入预冷的细胞浆提取试剂Ⅱ后，剧烈涡旋5 s，之后冰上静置1 min；4℃、16 000 g离心5 min，迅速转移上清至新管中，作为浆蛋白；在原管离心后的沉淀中加入细胞核提取试剂，剧烈涡旋15 s后冰上静置10 min，重复4次；4℃、16 000 g离心10 min后，取上清至新离心管中，作为核蛋白。

将FLAG-Mu2表达质粒转染至S2细胞后，收集细胞后均匀分配，分别进行总蛋白和核浆蛋白提取。向总蛋白、浆蛋白和核蛋白提取液中加入30 μL FLAG-M2琼脂糖珠，于4℃层析冷柜中旋转孵育3 h后，采用PBS洗涤3次，弃净上清后，加入与琼脂糖珠等体积的电泳上样缓冲液，进行蛋白质印记实验。

取10μg蛋白进行SDS-PAGE分离；4℃冷柜中以200 mA恒流3 h将蛋白转移至PVDF膜上；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；FLAG单克隆抗体(1 mg·L^-1)室温孵育2 h；TBST洗膜后，HRP标记的羊抗鼠二抗(1:5 000稀释)室温孵育1 h；TBST洗膜后，进行ECL发光检测。

将FLAG-Mu2表达质粒稳定转染至S2细胞后进行核蛋白提取。在核提取液中加入FLAG M2琼脂糖珠，4℃冷柜中过夜孵育。孵育之后的FLAG琼脂糖珠经用含0.2 g·L^-1FLAG多肽的溶液进行洗脱，经10%~60%甘油梯度离心后，再用Superose 6 10/300 GL凝胶过滤柱分离，之后行SDS-PAGE电泳，最终将凝胶进行硝酸银染色。并将染色条带所在处凝胶切下进行蛋白质质谱分析。

2.1共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白在S2细胞中的定位

在546 nm的激发光下，大部分细胞中可以观察到红色荧光，说明转染效率较高。红色荧光指示的FLAG-Mu2蛋白阳性表达率达50%，其中FLAG-Mu2蛋白强表达率约为30%。FLAG-Mu2蛋白主要呈核着色，与蓝色荧光显示的细胞核重叠，说明FLAG-Mu2蛋白定位于细胞核中。见图 1(插页一)。

A: Nucleus stained by TOPTO3 (blue); B: FLAG-mu2 stained by anti-FLAG antibody (red); C: Merged image. 图 1 共聚焦荧光显微镜下观察FLAG-mu2蛋白在S2细胞中的定位 Figure 1 Localization of FLAG-mu2 protein in S2 cells observed by confocal fluorescence microscope

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在转染FLAG-Mu2表达质粒的细胞蛋白中约140 000位置处检测到外源蛋白的表达，而对照细胞相同位置未见蛋白条带。FLAG-Mu2在细胞核提取物中的表达量较大，在细胞浆提取物中的表达量较小，说明FLAG-Mu2蛋白主要存在于S2细胞核提取物中。见图 2。

Lane 1, 3, 5: Cells tranfected with control vector; Lane 2, 4, 6: Cells tranfected with FLAG-Mu2; Lane 1, 2: Whole cell lysates; Lane 3, 4: Cytosol extractions; Lane 5, 6: Nuclear extractions. 图 2 Western blotting法检测S2细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白表达 Figure 2 Expressions of FLAG-Mu2 protein in nuclear extractions of S2 cells detected by Western blotting method

图选项

SDS-PAGE后对凝胶进行银染及Western blotting检测，以FLAG抗体进行检测显示FLAG-Mu2蛋白主要存在于第3泳道的洗脱液组分中，其蛋白复合物相对分子质量约为300 000。见图 3。

Lane 1-13:Fractionated purifications; Upper: Silver staining method; Bottom: Western blotting method. 图 3 免疫沉淀纯化FLAG-Mu2蛋白复合物的电泳图 Figure 3 Electrophoregram of purified FLAG-Mu2 protein complex by immuno-precipitation

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将第3泳道中的主要条带切下后进行质谱测序。作为诱饵蛋白的FLAG-Mu2被成功沉淀(条带3)，初步鉴定其蛋白复合物的其他可能组分包括pif1A (PFRAIRE-interacting factor 1A)、CG31782、mip120(Myb-interacting protein 120)、CG31690和G protein-sa60A。见图 4。

Lane1:PFTAIRE-interacting factor 1A, pif1A;Lane 2:CG31782;Lane 3:MU-2(bait); Lane 4:Myb-interacting protein 120, mip120;Lane 5:CG31690;Lane 6:G protein-sa60A. 图 4 FLAG-Mu2蛋白复合物成分初步鉴定的电泳图 Figure 4 Electrophoregram of identification of components of FLAG-Mu2 protein complex

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果蝇S2细胞是一个高效的蛋白表达系统，具有表达量高并且产物蛋白构像接近天然状态的优点，且培养要求低并且容易操作，因此适用于蛋白质的功能研究。蛋白所行使的生物学功能与其在细胞中的定位密切相关，根据蛋白的亚细胞定位可以合理推测基因的功能。Mu2蛋白由1 353个氨基酸组成，相对分子质量为139 000, 其N末端具有FHA结构域和HLH结构域，C末端具有2个串联的BRCT结构域，中间和靠C末端处有3个核定位信号，提示了该蛋白的核定位及具有与DNA结合的能力^[6]。BRCT结构域是一个磷酸化的蛋白结合结构域，许多参与DNA损伤修复和细胞周期调控的蛋白均具有该结构域^[7]。迄今为止，关于Mu2蛋白的生物学功能的研究也主要集中在其DNA损伤修复功能。在卵细胞中，Mu2蛋白突变造成DNA双链断裂处的修复率降低^[3]；在体细胞中，Mu2蛋白还具有细胞周期检查点功能^[4]。本研究结果显示:在果蝇S2细胞中Mu2蛋白主要定位于细胞核，这与相关研究^[3-4]结果相符。

根据Mu2蛋白的氨基酸序列及其结合蛋白的特点，提示其与人的DNA损伤检查点介质1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1, MDC1)同源^[3]。MDC1是参与哺乳动物细胞中DNA双链断裂修复的重要因子^[8]，其介导许多磷酸化依赖的蛋白相互作用^[9-10]。基于其在DNA损伤修复过程中的重要作用，MDC1影响肿瘤细胞对放化疗的敏感性^[11-12]。同时，MDC1还具有转录调控功能，其与雄激素受体(androgen receptor，AR)相互作用，作为AR的辅调节因子通过影响组蛋白乙酰化酶GCN5的招募而促进AR介导的转录，在前列腺癌中参与抑制肿瘤的作用^[5]；MDC1还能与雌激素受体(estrogen receptor，ER)相互作用，上调ER的转录活性，在乳腺癌中具有抑制肿瘤细胞生长的功能^[13]。此外，MDC1还在精子发生过程中起作用^[14]。MDC1的多功能性提示Mu2蛋白在果蝇中也可能具有DNA损伤修复外的新的功能。因此，筛选Mu2蛋白的相互作用蛋白提示Mu2蛋白中存在未发现的其他功能，并同时为其同源蛋白MDC1的进一步研究提供了实验依据。

通过纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行质谱分析，本课题组发现了Mu2蛋白复合物中5种可能的蛋白组分。其中，pif1A是具有hZIP结构域的转录因子^[15]；CG31782含有C2H2型锌指结构域，预测其具有转录因子活性；mip120是Myb复合物的组分之一，于特定染色质位置上依赖其他因子在DNA复制过程中起双重作用^[16]；CG31690具有N-乙酰葡糖胺转移酶活性，含TRP结构域，该结构域在蛋白-蛋白相互作用中起重要作用^[17]；G protein-sa60A参与G蛋白偶联受体信号通路^[18]。尽管这些蛋白与Mu2的相互作用需要进一步验证，但其参与不同信号通路、拥有不同的生物学功能，提示除参与DNA损伤修复的作用外，Mu2的生物学功能仍有待深入研究。

本研究成功地进行了FLAG-Mu2表达载体的转染和表达，观察了Mu2蛋白在S2细胞中的亚细胞结构定位，并筛选到5种可能与Mu2形成复合体的蛋白，为进一步研究Mu2蛋白的功能奠定了实验基础。