2016, Vol. 42扩展功能
文章信息
- 齐佳, 孙新华, 黄粲, 娄译心, 汪洋, 申玉芹
- QI Jia, SUN Xinhua, HUANG Can, LOU Yixin, WANG Yang, SHEN Yuqin
- 新型多级孔生物玻璃对人成骨细胞增殖和分化的促进作用
- Promotive effect of a new type of mesoporous bioactive glass on proliferation and differentiation of human osteoblasts
- 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(06): 1049-1053
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(06): 1049-1053
- 10.13481/j.1671-587x.20160602
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-13
2. 吉林大学食品科学与工程学院食品质量与安全系, 吉林 长春 130062;
3. 吉林大学口腔医院牙周病科, 吉林 长春 130021
2. Department of Food Quality and Safety, School of Food Science and Engineering, Jilin University, Changchun 130062, China;
3. Department of Periodontology, Stomatology Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China
生物玻璃(bioactive glass, BG)是一种由多种无机离子组成的具有优良的生物相容性和成骨活性的生物活性材料[1]。新型多级孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass with a hierarchical porous structure, MBG)具有BG材料的生物活性，不仅具有介孔更利于靶向药物的装载，并且具有孔径大、比表面积高、有利于细胞黏附、形貌可控、促进成骨功能强等优点，在骨组织重建和骨替代修复等研究中备受关注[2-3]。目前国外学者以NaCl做为大孔模板，在合成MBG的过程中加入具有生物降解性的有机物聚-3-羟基丁酸酯(PHB)以提高材料的机械强度，可以促进细胞黏附增殖[4]。也有学者[5]以环境友好、价格低廉且无毒害的天然植物茎作为大孔模板，制备了具有较好成骨性能的新型MBG[5]。本研究所采用的MBG是以地中海海绵为模板合成的一种MBG，由吉林大学食品科学与工程学院自主研制，目前研究[6-7]已证实：与以人工材料为模板的MBG比较，该MBG材料资源丰富、价格低廉且可回收，因而具有较好的应用前景。目前该材料的生物学活性尚未完全清楚，为探讨该新型MBG材料的生物学活性，本研究以人成骨细胞MG63作为目的细胞，检测MBG对成骨细胞增殖和分化的影响，探讨MBG对成骨细胞生物学性能的影响，为MBG用于骨重塑的研究奠定实验基础。
1 材料与方法 1.1 细胞、主要试剂和仪器人成骨样细胞系MG63(ATCC CRL-1427，吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室保存)。地中海海绵合成的MBG和普通生物玻璃(NBG)(吉林大学食品科学与工程学院提供)，HG-DMEM培养基(Gibco公司，美国)，胎牛血清和青霉素-链霉素(PAA公司，美国)，胰蛋白酶和四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma公司，美国)，磷酸盐缓冲液(PBS)(吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室配制)，碱性磷酸酶(ALP)试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(南京建成生物有限公司，中国)，反转录试剂盒(Frement公司，美国)，荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司，日本)。酶标仪RT-6000(BioTek公司，美国)，倒置显微镜(Olympus公司，日本)，超净台(Airtech公司，苏州)，CO2恒温细胞培养箱(Sanyo公司，日本)，电子天平(上海恒平仪器厂，中国)，96孔平底板、6孔平底板和10cm培养皿(COSTAR公司，美国)。
1.2 MBG和NBG浸提液的制备称取MBG和NBG各2 g，高温高压灭菌后分别浸没于10 mL培养液中，37℃恒温水浴摇床中持续振荡72 h。置于4℃冰箱保存备用。
1.3 MG63细胞的培养复苏MG63细胞，加入含10% FBS的HG-DMEM完全培养基，置于5%CO2、37℃细胞培养箱中孵育，隔天换液1次，待细胞融合约铺满80%时，传代培养，弃培养液，PBS冲洗2次，0.25%胰酶消化，收集细胞、计数待用。
1.4 MTT比色法检测MG63细胞增殖率MG63细胞接种至96孔板(每孔5×103个细胞)，每组设5个平行孔，加入含10%FBS的DMEM培养液于37℃、5%CO2条件下孵育24 h，去除培养液，分别加入200μL MBG浸提液(MBG组)、NBG浸提液(NBG组)、空白培养基(空白对照组)，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1、3和5 d，MTT比色法测定波长490 nm处各孔吸光度(A)值。以A值代表MG63细胞增殖率。
1.5 酶联免疫法检测MG63细胞中ALP的活性MG63细胞接种至96孔板(每孔5×103个细胞)，分组方法同1.4，分别孵育1、3和5 d，根据ALP试剂盒说明书中提供的方法处置各孔细胞，酶联免疫法检测各孔细胞中ALP及BCA蛋白A值，计算各组细胞中ALP活性。ALP活性(g·mL-1)=(待测A值-空白A值)/(酶标准A值-空白A值)×0.02/待测蛋白浓度。
1.6 实时定量PCR法检测MG63细胞中成骨相关基因Sp7 mRNA和Runx2 mRNA的相对表达水平将MG63细胞接种于6孔板中(每孔5×105个细胞)，24 h细胞完全贴壁后，分组方法同1.4，分别孵育24 h，试剂盒提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，实时定量PCR (Real-time PCR)法检测细胞中Runx2mRNA和Sp7 mRNA的相对表达水平。以GAPDH为内参基因，引物由日本TaKaRa公司设计并合成(表 1)。实时定量PCR反应体系：引物(10μmol·L-1)各0.5μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，DyeⅡ 0.5μL，模板cDNA 2μL，三蒸馏水(dddH2O)补足总体积至25μL。反应条件: 95℃、60 s，95℃、5 s，60℃、60 s，95℃延伸15 s，循环40次。采用M×3005P荧光定量PCR仪联机软件进行Ct值相对定量分析, 确认反应的扩增曲线和熔解曲线，生成曲线应为完全单一峰。以GAPDH为内参基因，采用相对定量2-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参基因表达的倍数，比较基因的表达差异。
| Gene | Primer sequence | Length (bp) | Temperature (θ/℃) | Percentage of GC (η/%) | Size (bp) | Accession No. |
| RUNX2 | F:5′-GAGArCATCGCCGACCAC-3′ R:5′-TACCTCTCCGAGGGCTACC-3′ |
18 19 |
52.12 53.57 |
61.11 63.16 |
135 | NM_00101 5051.3 |
| Sp7 | F:5′-CACAGCTCTTCTGACTGTCTG-3′ R:5′-CTGGTGAAATGCCTGCATGGAI-3′ |
21 22 |
50.40 55.60 |
47.62 50.00 |
103 | NM_00117 3467.1 |
| GAPDH | F:5′-CACAGCTCTTCTGACTGTCTG-3′ R:5′-CTGGTGAAATGCCTGCATGGAI-3′ |
18 20 |
49.86 54.37 |
55.56 55.00 |
70 | NM_00204 6.3 |
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组MG63细胞增殖率、MG63细胞中ALP活性和Runx2mRNA及Sp7 mRNA的相对表达水平以x±s表示, 组间比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。
2 结果 2.1 MBG的形态表现扫描电镜分析，MBG中有高度多孔结构作为支架，其中大孔径为2~5μm。见图 1。
|
| 图 1 扫描电镜下观察MBG的形态表现(bar=5μm) Figure 1 Morphology of MBG detected by scanning electron microscope (bar=5μm) |
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培养1、3和5 d时，MBG组MG63细胞增殖率高于空白对照组和NBG组(P＜0.01)。NBG组和空白对照组MG63细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。
| (x±s) | |||
| Group | Proliferation rate of MG63 cells | ||
| (t/d)1 | 3 | 5 | |
| Blank control | 0.149±0.004 | 0.751±0.046 | 0.581±0.033 |
| NBG | 0.176±0.025 | 0.464±0.039 | 1.236±0.037 |
| MBG | 0.423±0.041*△ | 3.291±0.139*△ | 1.773±0.020*△ |
| *P＜0.01 vs blank control group；△P＜0.01 vs NBG group. | |||
培养1、3和5 d时，MBG组MG63细胞中ALP活性表达均明显高于空白对照组和NBG组(P < 0.01)；NBG组和空白对照组MG63细胞中ALP活性比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。
| [x±s, ρB/(mg·L-1)] | |||
| Group | ALP activity | ||
| (t/d) 1 | 3 | 5 | |
| Blank control | 4.93±0.23 | 46.43±2.88 | 34.47±3.07 |
| NBG | 3.41±0.35 | 18.28±1.61 | 20.44±3.89 |
| MBG | 5.41±0.51*△ | 79.06±2.58*△ | 91.23±1.78*△ |
| *P＜0.01 vs blank control group；△P＜0.01 vs NBG group. | |||
MBG组MG63细胞中Sp7 mRNA相对表达水平高于空白对照组和NBG组(P＜0.01)；而Runx2 mRNA的相对表达水平组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 4。
| (x±s) | ||
| Group | Relative expression level of Sp7 mRNA |
Relative expression level of Runx2 mRNA |
| Blank control | 1.000±0.092 | 1.012±0.021 |
| NBG | 1.014±0.010 | 1.275±0.103 |
| MBG | 10.007±2.760*△ | 3.040±0.224 |
| *P＜0.01 vs blank control group；△P＜0.01 vs NBG group. | ||
1969年Hench[8]研制出熔融法制备生物活性玻璃45S5并于1985年开始应用于临床，在临床治疗中取得良好的骨修复效果，成为生物活性材料中的重要组成部分。目前对生物活性玻璃的微观结构、形貌、理化和生物学性能的研究仍在不断深入。近年来，学者们[9-11]期望寻找到可以促进骨修复的理想支架材料，MBG因其对骨组织的修复作用受到广泛关注。本研究选取的MBG材料是由吉林大学食品科学与工程学院自行研制开发的以地中海海绵为模板合成的MBG材料，具有环境友好、价格低廉和来源丰富等优点[6-7]，但其与活体细胞的作用目前尚未见报道。本研究探讨该新型材料对成骨细胞增殖、分化及矿化能力的影响，为将其进一步发展为骨组织修复替代材料或骨组织工程支架材料提供理论依据。
成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，可以分泌大量的骨胶原和其他骨基质、细胞因子和酶类，从而启动骨形成过程，并抑制破骨细胞活性，因而对骨组织的生长发育、损伤修复、骨代谢平衡和骨量维持均起关键作用[12]。本研究选取的成骨样细胞株MG63与普通成骨细胞表型接近，具有多次传代后仍能保持稳定细胞表型的特性，因此成骨相关的研究中多采用成骨样细胞株作为研究对象[13]。为证实该材料在骨修复过程中对成骨的影响，本研究选取人成骨样细胞MG63作为目的细胞，观察MBG材料对MG63细胞毒性影响的结果显示：MBG可促进MG63细胞的增殖。生物活性玻璃的主要成分为磷、钙和硅, 其表面部分在水溶液中形成的界面对成骨细胞有强亲和性，材料中的一些成分可以同生物体内成分互相交换或者反应, 最终形成可以与生物体兼容的物质而成为新生骨骼的一部分。MBG较NBG有更高的比表面积，浸提液中有更多的促成骨相关离子析出，本研究结果表明该材料符合国家对医用生物材料细胞毒性的要求，可以为后续实验提供基础。
成骨细胞的成骨分化功能是骨形成的关键。ALP是参与骨组织形成、代谢和再生的一种重要蛋白，是成骨细胞分化的重要标志物，其活性随细胞分化能力的增强而增加[14]。本研究结果显示：MBG组MG63细胞中ALP活性较空白对照组和NBG组明显升高，证明该MBG材料在成骨细胞分化早期可上调ALP表达，鉴于ALP的活性可作为体外实验评价成骨分化的手段[15-16]，本实验结果提示该MBG材料具有促进成骨细胞分化的作用。
Runx2与Sp7是成骨细胞成骨分化的特异性转录因子[12-13]，其中Runx2可调控众多基因的转录，被认为是成骨细胞分化的主宰基因，参与成骨细胞分化的早期调控[17]；Sp7是鼠源性成骨细胞表达的转录因子osterix的人类同源物，在成骨细胞的增殖、成熟和活化过程中起重要作用, 也是成骨细胞分化、增殖、成熟和活化所必需的关键转录因子[18]。Runx2位于Sp7的上游，调控细胞向成骨细胞分化[19]。研究[12-13]显示：在成骨细胞分化过程中，Runx2和Sp7均呈高表达。本研究结果表明：MBG可明显升高Sp7 mRNA的表达水平，但对Runx2基因表达水平无明显影响。研究[20-22]显示：细胞外基质可以通过诱导Runx2转录活性增强，而不是上调Runx2 mRNA表达水平而促进其下游转录因子Sp7基因表达，该新型MBG是否通过增强Runx2转录活性，促进Sp7 mRNA表达，进而促进MG63的成熟分化，尚有待进一步研究。
综上所述，与NBG比较，该MBG材料具有细胞毒性小和可促进成骨细胞分化的优势，有望作为骨组织修复替代材料或骨组织工程支架材料，其具体作用机制尚需进一步研究和探索。
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