炎症和免疫反应在急性冠脉综合征(acute coronary syndromes，ACS)发生和发展过程中起重要作用^[1]。研究^[2]表明：CD4⁺T淋巴细胞亚群Th1、Th2及调节性T细胞(Treg)之间的失衡参与了动脉粥样硬化斑块炎症与免疫反应的过程。研究^[3]表明：Treg可延缓动脉粥样硬化的发展，ACS患者外周血中CD4⁺CD25⁺Treg数量明显减少。Treg具有明显的抑制动脉粥样硬化和稳定斑块的作用，ACS的发生与Treg数量减少明显相关。既往研究^[4]证实：内皮细胞微粒(endothelial microparticles，EMPs)不仅可作为ACS的标志物，还可介导细胞间信号转导或作为效应物参与各种病理生理过程。尽管本课题组既往的研究^[5]已经证实EMPs参与了ACS患者CD4⁺T淋巴细胞分化与功能的调控，但对其亚群CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg分化和功能的调控作用尚不清楚。本研究进一步探讨ACS患者外周血EMPs与Treg细胞的关系，阐明EMPs通过影响Treg细胞分化和功能，参与ACS发病过程的机制及意义。

选取2014年7月—2015年6月于广西壮族自治区钦州市第二人民医院心内科入院治疗的冠心病患者75例，其中男性48例，女性27例，年龄41～84岁，平均年龄(62.0±8.8)岁。按1979年WHO冠心病诊断和分型标准分为2组：稳定性心绞痛组(SAP组，n=23)和ACS组(ACS组，n=52)。ACS组包括急性心肌梗死患者20例和不稳定性心绞痛患者32例。以同期经冠状动脉造影检查和临床症状排除冠心病的住院患者20例作为对照组。所有受试者均排除感染、肿瘤、风湿、肝肾功能不全、血液系统疾病、自身免疫性疾病及服用类固醇类和免疫抑制剂。各组患者一般临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表 1。

ACS组患者入院后即刻，对照组和SAP组患者于入院后第2天早晨空腹抽取新鲜外周静脉血3 mL，160 g离心10 min分离出富含血小板的血浆，然后1 500 g离心6 min分离出血小板贫瘠的血浆。将特异性荧光标记抗体(anti-CD42-FITC,anti-CD31-PE)0.5 μg或等量的同型对照抗体(mice IgG₁/PE，mice IgG₁/FITC)(美国BD公司)加入到50 μL血小板贫瘠的血浆中。室温下孵育20 min，随后加入1 mL PBS液后采用流式细胞仪检测。采样后4 h内完成检测。EMPs定义为直径小于1.0 μm且CD31⁺/CD42^-阳性的微粒。

抽取外周抗凝血2 mL，分离单个核细胞(PBMC)，将细胞浓度调整为2×10⁶ mL^-1，均分为对照管和检测管，加入CD4^- FITC抗体和CD25^- APC抗体，室温避光孵育20 min，然后加Foxp3固定破膜剂进行固定和破膜后，加入Foxp3-PE抗体或IgG₁(同型对照)，室温避光孵育30 min，PBS液洗2次，重悬后上流式细胞仪检测Treg细胞百分率。

mRNA表达水平 分离获取外周血单个核细胞(PBMC)，用Trizol一步法提取总RNA，并进行逆转录合成cDNA。建立qPCR反应体系，以GAPDH作为内参,测定Foxp3 mRNA表达水平。目的基因的引物序列，GAPDH: sense 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，antisense 5′-TGGTGAAGAC-GCCAGTGGA-3′；Foxp3: sense 5′-CTACGCCACGCTCATCCGCTGG-3′，antisense 5′-GTAG-GGTTGGAACACCTGCTGGG-3′。PCR反应条件：95℃预变性10 s，95℃、5 s，退火15 s，72℃、10 s，共40个循环。PCR反应退火温度为58℃。扩增反应结束后，从72℃缓慢加热到95℃，以建立PCR产物的熔解曲线。每个标本均设置2个复管PCR反应。采用公式2^-ΔΔCt计算Foxp3 mRNA的相对表达量，^ΔΔCt=病例组(Ct_目的基因-Ct_内参基因)-对照组(Ct_目的基因-Ct_内参基因)。

ACS组患者入院后即刻、对照组和SAP组患者入院后第2天早晨空腹用真空抗凝试管抽取新鲜外周静脉血2 mL，将全血以3 000 r·min^-1离心15 min，取上层血清分装后存于-80℃冰箱中待测。所有标本收集后采用ELISA法集中检测血浆中TGF-β₁水平。操作严格按说明书进行，TGF-β₁的灵敏度为15 ng·L^-1。

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。患者年龄、EMPs水平、Treg百分率、 Foxp3 mRNA表达水平和血浆TGF-β₁水平均以x±s表示，多组间比较如Treg百分率和 Foxp3 mRNA表达数据符合正态性分布且方差齐，采用单因素方差分析并采用LSD法进行两两比较；而EMPs水平和血浆TGF-β₁水平符合正态分布，但方差不齐，则采用Kruskal-Wallis秩和检验，两两比较采用Bonferroni法校正P值；临床特征中性别、危险因素、药物使用等计数资料采用频数及构成比表示，组间比较采用χ²检验。EMPs与Treg细胞、Foxp3 mRNA表达水平和血浆TGF-β₁水平的相关性采用直线相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

ACS组患者血浆EMPs水平、Treg细胞百分率、Foxp3 mRNA表达水平和血浆TGF-β₁水平明显高于对照组和SAP组(P＜0.01)。见表 2。

直线相关分析结果显示：ACS组患者血浆EMPs水平与Treg细胞百分率、Foxp3 mRNA表达水平和TGF-β₁水平呈明显负相关关系(r=-0.452，P=0.001；r=-0.466，P=0.001；r=-0.555，P=0.000)。

本研究结果显示：ACS组患者EMPs水平明显高于对照组和SAP组患者，此结果与既往研究^[6]结果相似。EMPs作为内皮细胞损伤或凋亡后以囊泡形式释放的产物，具有起源细胞的特征和表型，因此可以作为评价内皮细胞功能的重要标志物^[7]。本研究证实：对照组患者外周血也可检测到一定量的EMPs，但其生理作用尚不清楚。本研究观察到SAP组患者EMPs轻度增高，可能与冠状动脉慢性炎症和免疫性反应所导致的内皮的慢性损伤和功能障碍有关。而ACS组患者EMPs明显升高，可能与严重冠状动脉血管内皮功能障碍及其相关的血管活性物质代谢失衡、斑块破裂和血栓形成有关^[8]。与此同时，ACS发生时，可导致大量炎性介质和血管活性物质的释放，可进一步损伤内皮细胞，加重内皮功能障碍^[9]。因此，EMPs可作为反应 ACS患者冠脉内皮损伤和功能障碍程度的指标。此外，由于EMPs表面携带有炎性物质，也可作为评价冠心病患者，特别是ACS患者冠脉内皮功能和内膜炎症反应程度的重要指标^[4]。

本研究结果还显示：ACS患者CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg及其关键转录因子Foxp3 mRNA表达水平和主要效应分子TGF-β₁水平明显降低，此结果与既往研究^[10]结果一致。但对照组和SAP组患者上述指标比较无明显差异。研究^[11]表明：CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg的上调可显著改善动脉粥样硬化，因此其在AS发生和发展过程中参与了免疫负调控。在ACS患者中，CD4⁺T淋巴细胞亚群如Th1/Treg、Th17/Treg的失衡可导致斑块不稳定^[12-13]。有研究^[14-15]证实：ACS患者外周血CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg占CD4⁺T淋巴细胞的比率减少，导致Th1/Th2淋巴细胞比例失衡，最终使动脉粥样硬化斑块的不稳定性增加，促使ACS的发生。

本研究还证实EMPs与CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg数量、影响其分化的关键转录因子Foxp3mRNA表达水平及主要细胞因子TGF-β₁水平呈显著负相关关系。

EMPs是反映内皮功能障碍的指标，而CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg则是反映冠心病患者内膜炎症与免疫反应的指标，两者相关性分析表明：ACS患者炎症、免疫反应与内皮功能障碍之间存在着内在的联系，两者可能互为因果。一方面CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg数量及功能的下调，对冠脉炎症和免疫反应抑制作用减弱，可进一步加重冠脉内皮损伤和功能障碍，导致EMPs增多。因此，ACS患者EMPs明显增加，可能是冠脉炎症和免疫反应加剧的结果。但另一方面，EMPs不仅可作为ACS内皮功能障碍的标志物，由于其表面携带有大量的生物活性物质，参与对CD4⁺T淋巴细胞亚群分化与功能的调控^[5],因此EMPs也可能通过抑制CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg分化及功能，部分参与冠状动脉粥样硬化发生发展及ACS发生的病理过程。但本研究结果表明：EMPs与CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg在SAP患者中的变化并不一致，其原因可能与冠状动脉病变早期即有明显内皮功能障碍，而此时CD4⁺T淋巴细胞亚群参与的免疫反应仅局限于斑块中，外周血中表现尚不显著有关。而在ACS患者中，由于炎症、免疫反应与内皮功能障碍较SAP患者更为显著，因此EMPs明显增加。而EMPs可能需要达到一定数量级才能产生明显的病理作用，或在ACS状态下EMPs所携带的生物活性物质有明显不同，从而对CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg分化及功能产生作用。此时，两者相互作用和促进，共同参与了ACS发生。

综上所述，ACS患者外周血中EMPs与CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg分化和功能密切相关，两者在一定程度上反映了内皮功能障碍和斑块内炎症反应程度，可作为衡量斑块稳定性的指标。此外，EMPs还可能通过调控CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg的分化和功能，参与冠状动脉动脉粥样硬化的发生发展及斑块不稳定的过程。