缺氧是恶性肿瘤在生长过程中普遍存在的现象，肿瘤细胞主要是通过缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)对缺氧环境进行调节。HIFs是一类转录因子，包括 HIF-1、HIF-2和HIF-3 3种亚型。其中HIF-1α与 HIF-2α作为其功能亚单位对细胞内缺氧发挥着特殊作用，HIF-1α与 HIF-2α结构上差别极其细微，但二者的功能却并不相似^[1]。目前对于HIF-1α在肿瘤中作用的研究^[2-3]较多且广泛，对于HIF-2α在肿瘤中作用的研究相对较少。本实验应用免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中HIF-2α、CD31、Ki67和GST-π的表达，探讨HIF-2α在NSCLC血管生成、细胞增殖及化疗耐药中的作用,为NSCLC的治疗提供理论依据。

收集2006年1月—2010年7月内蒙古医科大学附属医院经常规病理学检查证实的112例NSCLC患者癌组织蜡块标本和20名正常人肺组织，所有标本均经甲醛固定、石蜡包埋并行3 μm厚连续切片。112例NSCLC患者中，男性81例，女性31例；年龄20～78岁，中位年龄59岁。根据 2004年WHO分类标准，肺腺癌40例，肺鳞癌72例；高分化 28例，中分化60例，低分化24例；无淋巴结转移者60例，有淋巴结转移者52例；Ⅰa期17例，Ⅰb期15例，Ⅱa期21例，Ⅱb期19例，Ⅲa期35例，Ⅲb期3例，Ⅳ期2例。

鼠抗人HIF-2α(ep190b)单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，鼠抗人CD31单克隆抗体、鼠抗人Ki67单克隆抗体、鼠抗人GST-π单克隆抗体和EnVision免疫组织化学试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

采用免疫组织化学EnVision法，严格按试剂盒说明书操作。标本以3 μm厚连续切片，65℃烤箱烤片2 h，常规脱蜡，梯度酒精水化，滴加3%过氧化物酶阻断溶液，室温孵育10 min，微波抗原修复，滴加一抗，4℃冰箱孵育过夜。次日PBS冲洗3×3 min，滴加生物素标记的二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗3×3 min，滴加DAB显色液，自来水冲洗，苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度酒精干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

免疫组织化学结果判定由2名经验丰富的病理医师分别进行独立阅片。HIF-2α染色阳性主要表现为细胞浆呈黄色或棕黄色颗粒，细胞核偶可见染色阳性，根据肿瘤细胞的染色强度和染色范围进行计分。1分：肿瘤细胞细胞浆染色阴性或淡黄色，无核阳性；2分：肿瘤细胞细胞浆染色呈黄色及棕黄色，染色范围小于30%，无核阳性；3分：肿瘤细胞细胞浆染色呈黄色及棕黄色，染色范围大于30%，无核阳性；4分：肿瘤细胞细胞浆染色呈黄色及棕黄色，染色范围大于30%，肿瘤细胞核染色阳性。其中得分1和2分者为HIF-2α低表达组，得分3和4分者为HIF-2α高表达组。微血管密度(microvessel density，MVD)按照参考文献^[4]判断并计数，用CD31标记血管内皮细胞。GST-π阳性染色主要分布于细胞浆和(或)细胞核，判断标准参见迈新试剂产品说明书。Ki67染色阳性分布于细胞核，按染色程度和范围综合评估^[5]，0～3分者为低表达，≥4分者为高表达。

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。HIF-2α在NSCLC组织和正常肺组织中的阳性表达率比较采用χ²检验；MVD值以x±s表示，组间比较采用t检验；HIF-2α的表达与Ki67及GST-π表达的相关性分析采用Spearman相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

HIF-2α在NSCLC组织中表现为细胞浆内出现程度不同的黄色或棕黄色颗粒(图 1，见插页四)，偶可见有细胞核染色阳性。

CD31抗体标记血管内皮细胞，在内皮细胞的细胞膜及细胞浆呈现黄色或棕黄色颗粒 (图 2，见插页四)。112例NSCLC组织MVD为27.5±15.6，HIF-2α高表达组MVD(31.1±14.7)高于HIF-2α低表达组(24.3±15.8)，二者比较差异有统计学意义(t=-2.358,P=0.02)。

Ki67在NSCLC组织中阳性染色位于细胞核，呈黄色或棕黄色(图 3，见插页四)。112例NSCLC中，Ki67低表达组67例，Ki67高表达组45例。在HIF-2α高表达组，Ki67高表达病例占54.7%(29/53)，在HIF-2α低表达组，Ki67高表达病例占27.1%(16/59)，2组患者间Ki67高表达率比较差异有统计学意义(P＜0.05)。经Spearman等级相关分析，HIF-2α与Ki67表达呈正相关关系(r=0.281,P=0.003)。

在NSCLC组织中GST-π阳性颗粒主要分布于细胞浆及细胞核，呈黄色或棕黄色(图 4，见插页四)。112例NSCLC组织中有87例呈阳性表达，阳性表达率为77.7%。HIF-2α高表达组GST-π阳性者占83.0%(44/53)，HIF-2α低表达组GST-π阳性者占72.8%(43/59)，2组患者间GST-π阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。经Spearman等级相关分析，HIF-2α与GST-π表达无相关关系(r=0.122,P=0.202)。

HIFs是一类普遍存在于人和哺乳动物体内的转录因子，由HIF-α和HIF-β2个亚基构成。HIF-α在细胞中的表达水平受到细胞外氧分压的严密调控，在正常氧分压的情况下，HIF-α在不断产生的情况下也在大量的降解，因此常氧条件下HIF-α的表达水平很低；而细胞在缺氧环境中时，HIF-α的降解受到抑制导致HIF-α蛋白在细胞内积聚而增多，同时也可以通过一系列信号通路来显著而且稳定地激活HIF-2α的表达。研究^[6]显示：在肿瘤生长早期过程就会出现缺氧现象，这时HIF-1α会出现迅速且短暂的升高，表现出VEGF表达增加，以此启动肿瘤的早期血管生成反应。随着血管生成的增加，缺氧的状态被改善，此时HIF-1α表达水平降低，而HIF-2α表达水平升高，并通过 HIF-2α上调某些血管生成因子，以此来维持血管的不断生成。本实验检测了112例NSCLC石蜡标本中HIF-2α蛋白表达情况，HIF-2α主要表达于NSCLC细胞的细胞浆中，偶可伴细胞核染色阳性，而在正常肺组织中一般不表达或表达较弱，这与一些学者^[7]的研究结果类似。Keith 等^[8]的研究结果表明：在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌和恶性胶质瘤等多种肿瘤组织中HIF-2α的表达水平显著升高。NSCLC作为一种实体肿瘤，肿瘤细胞所需营养有赖于血管的供应，在肿瘤生长过程中伴随有血管的形成，而衡量肿瘤血管生成较好的指标是肿瘤的MVD值。本实验应用CD31标记血管内皮细胞，计数肿瘤的MVD值，结果显示：112例NSCLC组织MVD均值为27.5±15.6,且HIF-2α高表达组MVD值明显高于HIF-2α低表达组，提示HIF-2α能促进肿瘤血管生成,提供肿瘤细胞的生长增殖、侵袭转移所需要的氧,在NSCLC的发生发展和侵袭转移中发挥重要的作用。一些学者^{[4, 9-10]}在其他肿瘤中也发现HIF-2α有促进血管生成的作用。目前以抑制肿瘤血管生成为靶点的药物已经应用在肺癌治疗的临床试验中^[11]。

Ki67 是一种与细胞增殖有关的蛋白，主要表达于细胞核内，其功能与细胞的有丝分裂及细胞周期有关^[12]。Ki67在细胞增殖周期中除G₀期外在各期中均有表达，其半衰期较短，一旦增生期结束后，细胞内表达的Ki67就会迅速降解，因此对Ki67蛋白的检测具有可靠性，其是目前被广泛应用于检测细胞增殖状态的主要标记物之一。大量研究^[13-14]表明：Ki67的高表达与恶性肿瘤的分期、淋巴结转移具有明显的正相关关系，提示Ki67的表达是判断恶性肿瘤预后的一个有价值的指标。本研究结果显示：HIF-2α表达与Ki67表达存在正相关关系，提示HIF-2α和Ki67在恶性肿瘤增殖过程中具有协同作用，在肿瘤细胞缺氧过程中，HIF-2α通过其表达增加可能上调Ki67等基因的表达，从而进一步增强恶性肿瘤细胞的增殖能力，为其后续的浸润进展提供条件。但是HIF-2α与Ki67两者之间相互作用的确切机制尚需要进一步研究。

肿瘤细胞产生化疗耐药的原因很多，目前研究比较多的耐药基因有PgP、GST-π和ToPo-Ⅱ。GST-π属于谷胱甘肽S转移酶家族的一员，其能够与亲脂性细胞毒性药物结合增加其水溶性，促进药物的代谢，因而可以降低抗癌药物的细胞毒作用。本研究结果显示：在112例NSCLC组织中有87例GST-π呈阳性表达，HIF-2α表达与GST-π表达之间无明显相关性。上述结果表明：在NSCLC组织中出现化疗药物的耐药现象可能不止是单一因素作用的结果，而是多个耐药基因协同作用的结果，同时也是多步骤、多阶段综合作用的结果。

恶性肿瘤在生长过程中普遍都存在缺氧现象，HIF-2α是肿瘤细胞对缺氧反应调控的重要因素，并在此基础上有众多因素参与到肿瘤的发生及发展过程中。Semenza^[15]的研究结果表明：在乳腺癌组织中缺氧环境激活HIF-1和HIF-2，对于肿瘤的进展起到关键作用，而在乳腺癌转移到肺部是通过缺氧诱导如细胞黏附分子等发挥作用。

综上所述，HIF-2α可能会促进NSCLC组织血管生成,增强肿瘤细胞的生长和增殖能力,在NSCLC的发生发展过程中发挥重要的作用。