Dab1(Disabled-1,Dab1)基因编码含有555个氨基酸的细胞内重要的衔接蛋白，其N端具有磷酸酪氨酸结合/蛋白相互作用结构域(PTB/PI domain)，该结构域可与多个含有NPxY的跨膜蛋白结合^[1]。现有的关于Dab1的功能研究主要集中在神经系统发育中，其在肿瘤中作用的研究较少。人类的Dab1基因位于1p32.2染色体环的不稳定区域(普通型脆性位点，common fragile sites,CFS)，即基因缺失和修饰活跃区域，其在脑胶质瘤和子宫内膜癌中表达下调^[2]，但关于Dab1在乳腺癌进程中的作用并不十分清楚，尚未见相关文献报道。本研究检测Dab1基因在乳腺癌细胞中的表达情况及在乳腺癌BT-549细胞中外源过表达Dab1后其对细胞周期的影响，探讨Dab1与乳腺癌发生发展的关系。

人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，乳腺癌细胞系MCF-7、BT-549和MDA-MB-231购自上海细胞库。胎牛血清、马血清、MEM培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基和EDTA-胰酶购于美国Gibco公司;L15培养基、细胞因子EGF、糖皮质激素、霍乱毒素、胰岛素、鼠源Actin单克隆抗体、青霉素和链霉素等购于美国Sigma公司；兔源Dab1抗体购于Millipore公司;Lipofectamine 2000和PI染色试剂盒购于美国Invitrogen公司;M-MLV逆转录试剂盒购于美国Promega公司;SYBR染料法荧光定量试剂盒购于日本TaKaRa公司;pKH3和pKH3-Dab1质粒由Peggy教授惠赠。StepOne Plus^TM(美国ABI公司)，Bio-Rad垂直电泳槽(ZY057912)和转印槽(ZY057909)(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)。

MCF-10A培养基为DMEM/F12，同时添加5%马血清、20 μg·L ^-1细胞因子 EGF、0.5 mg·L^-1糖皮质激素，100 μg·L^-1 霍乱毒素，10 mg·L^-1胰岛素及青霉素和链霉素;MCF-7和BT-549细胞用含有10%胎牛血清的MEM及RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养。MDA-MB-231细胞用含有10%L15的培养基在37℃、无CO₂的培养箱中培养^[3]。当细胞贴壁生长达到板底的80%~90%时进行胰酶消化，吹散为单细胞，1 000 r·min^-1离心，培养基重悬后传代培养。对数生长期的细胞，按照每孔1×10⁵个细胞接种到6孔板，12~16 h后进行Lipofectamine 2000转染。250 μLopti-MEM中加入4 μg pKH3或pKH3-Dab1质粒，轻轻混匀;再取250 μL opti-MEM，加入10 μL Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温静止5 min。轻轻混匀Lipofectamine 2000和稀释的质粒，室温静止15 min，轻轻滴加到细胞培养板中，37℃、5% CO₂的培养箱中培养^[4]。4~6 h后更换新鲜培养基，36 h后进行流式细胞术检测。

PCR检测Dab1mRNA表达 ① RNA提取：细胞长满到80%~90%时，Trizol试剂盒提取细胞中总RNA，纯化后溶解在DEPC水中，分光光度计测量RNA的浓度及其纯度[A(260/280)值介于1.8~2.0]。② cDNA合成：采用M-MLV逆转录试剂盒，取1 μg提取的总RNA到DEPC处理过的PCR小管，置于70℃的热水浴中孵育10 min后分别加入反转录5×缓冲液、dNTP混合物、核苷酸酶抑制剂、M-MLV反转录酶和随机引物，42℃孵育30 min，95℃ 、5 min，4℃、5 min，反转录的cDNA可以直接用于PCR或于-20℃保存。③Real-time PCR反应：选用SYBR染料法荧光定量试剂盒，引物序列：Dab1基因正向引物，5′-AACCAGCGCCAAGAAAGACT-3′，反向引物，5′-GCAACAACGCCCTTGAGTTT-3′;Actin基因正向引物，5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′，反向引物，5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′;20 μL反应体系：SYBR Premiex 10 μL，正向、反向引物各0.4 μL，ROX Dye Ⅱ 0.4 μL，DNA模板1.0 μL (50~100 ng)，蒸馏水7.8 μL。反应条件：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、 35 s，95℃、 15 s，60℃、60 s，95℃、15 s，40个循环。获得Ct值后，按照2^-ΔΔCt法计算Dab1mRNA相对表达水平，将MCF-10A细胞中Dab1表达水平标准化为1。

blotting检测Dab1蛋白表达水平 收集融合度为80%~90%的细胞，PBS洗2次，预冷的RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，离心取上清，测定蛋白浓度，加入5×loading buffer，沸水中煮5 min。配制10%分离胶，5%浓缩胶，每孔上样量60 μg。5% BSA封闭结束后，一抗Dab1(1∶1 000)和Actin(1∶3 000)于4℃过夜，TBST洗3次，加入相应二抗，室温1 h，TBST洗3次，ECL发光底物进行曝光检测目的条带。 Gel-pro analyzer对条带进行积分光密度(IA)分析，以Actin为对照，获得MCF-10A、MCF-7、BT-549和MDA-MB-231的比值(IA_Dab1/IA_Actin)。

收集细胞，预冷PBS洗2次，预冷70%乙醇4℃固定过夜，离心收集细胞，预冷PBS洗1次，加入500 μL含50 mg·L^-1溴化乙锭(PI)的PBS缓冲液，加入100 mg·L^-1RNase A和0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min，流式细胞术检测分析细胞周期分布。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中Dab1 mRNA和蛋白相对表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

Real-time PCR法检测结果显示：将正常乳腺上皮细胞MCF-10A中Dab1mRNA表达水平标准化为1，MCF-7、BT-549和MDA-MB-231中Dab1mRNA相对表达水平分别为0.504±0.037、0.302±0.027和0.33±0.031(图 1A)；与MCF-10A细胞比较，MCF-7、BT-549和MDA-MB-231细胞中Dab1 mRNA表达水平明显下调(P＜0.05)。Western blotting法检测结果显示：MCF-10A细胞中有较丰富的Dab1表达，而MCF-7、BT-549和MDA-MB-231细胞中Dab1表达水平较低(图 1B)。Gel-Pro analyzer对条带进行光密度分析，以Actin为对照，MCF-10A、MCF-7、BT-549和MDA-MB-231的IA比值分别为0.227±0.021、0.134±0.014、0.076±0.010和0.074±0.005；与MCF-10A细胞 比较，MCF-7、BT-549和MDA-MB-231细胞中Dab1蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)(图 1C)。

图 1　Dab1在乳腺癌细胞中的表达 Figure 1　 Expressions of Dab1 in human breast cancer cells

图选项

Western blotting 法检测结果表明：BT-549细胞转染pKH3-Dab1后，Dab1蛋白表达水平升高(图 2A)。将未处理的对照组、转染pKH3组及转染pKH3-Dab1组BT-549细胞进行流式细胞术检测，结果显示：与对照组(29.29％)和转染pKH3组(37.12％)比较，转染pKH3-Dab1组BT-549细胞G₁期百分比(56.58％)增加，出现G₁期阻滞(图 2B)。

图 2　各组细胞中Dab1蛋白表达和细胞周期改变 Figure 2　Expressions of Dab1 in cells and changes of cell cycle in various groups

图选项

目前，关于Dab1功能的研究主要集中在大脑皮层发育过程中神经元的迁移和定位上。Dab1在发育的中枢神经系统中高表达，是Reelin信号通路中的关键成员^[5]，可维持微管稳定性、促进皮层神经元的迁移^[6]。然而，Dab1在肿瘤中的作用研究较少。已有研究^[7-10]表明：一些与微管稳定性相关的蛋白，如MAP-2、LC3、Tau 和CDK5等在肿瘤的生长或转移中发挥着重要的作用。因此，推测Dab1可能与肿瘤的发生发展相关。

McAvoy等^[2]报道：Dab1基因定位于一个大的基因组不稳定区域，该区域为基因缺失和修饰活跃区，相似基因如FHIT (1.5 Mb)、WWOX (1.0 Mb)、 GRID2 (1.36 Mb)、PARK2 (1.3 Mb)和RORA (730 kb)等，这些基因在许多肿瘤中呈失活状态，其中FHIT和WWOX已经被证明为抑癌基因。因此，定位于染色体环1p32.2CFS区域的Dab1基因是否也有抑癌基因的作用值得深入探究。已有文献^[2]初步报道了Dab1在脑胶质瘤和子宫内膜癌中表达下调，但至今为止，关于Dab1在乳腺癌细胞中的表达情况及其对乳腺癌进程的作用并不十分清楚。

本研究利用Real-time PCR和Western blotting法，分别在mRNA和蛋白水平对Dab1的表达进行检测，所选用细胞系分别为正常的乳腺上皮细胞系MCF-10A^[11]、恶性度较低的MCF-7^[12]、恶性度高的BT-549和MDA-MB-231细胞^[13-14]，结果显示：正常乳腺上皮细胞中Dab1表达丰富，恶性度较低的MCF-7中表达下调，恶性度高的BT-549和MDA-MB-231中下调幅度更大。本研究结果表明：Dab1在乳腺癌细胞中表达 下调，且初步提示Dab1的表达与乳腺癌恶性度密切相关，目前尚未有关于Dab1与肿瘤恶性程度存在相关性的报道，这一创新性发现将在后期大量的临床乳腺癌组织样本中进行验证。

在细胞中过表达Dab1可抑制肿瘤细胞的生长^[2]。因此，本文作者进一步对Dab1的作用机制进行深入研究： 将外源Dab1基因转入BT-549细胞，在确定BT-549细胞中外源Dab1表达后，采用流式细胞术检测细胞周期的变化。本研究结果显示：转染pKH3空载体的细胞与未处理细胞周期分布相似，而转染pKH3-Dab1的细胞出现G₁期阻滞，说明Dab1在正常细胞中的表达对调控细胞的正常周期发挥着必不可少的作用。

综上所述，Dab1在乳腺癌中表达下调，且Dab1对正常细胞周期发挥调控作用，提示Dab1是一个潜在的抑癌基因，可能为肿瘤治疗的新靶点。但关于Dab1的表达趋势在临床乳腺癌组织中是否一致以及Dab1表达下调的机制、下调的Dab1对乳腺癌细胞周期的具体作用机制等仍需进一步探讨。