研究^[1]显示：我国蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的发病率逐年升高，约为每年10.5/10万人口。除较高的死亡率外，约有60%以上SAH患者存在认知功能缺失及精神障碍等后遗症，给患者带来身体和心理上双重创伤^[2]。目前，SAH临床治疗中高度重视早期神经保护剂的应用，以防治SAH造成的神经功能缺陷。BQ-123是一种具有高特异性亲和力的内皮素受体(endothelin A receptor，ETA)拮抗剂，可降低血管痉挛、抑制交感神经系统及肾素-血管紧张素系统活性，目前已初步证实其对SAH有一定的保护作用^[3]，但具体作用机制尚不明确。研究^[4-5]显示：SAH导致神经功能缺陷的关键与脑损伤后细胞正常的稳态环境受到破坏，某些信号转导系统发生紊乱而致神经细胞死亡相关。自噬是真核细胞中产生的一种细胞防御机制，应激状态下自噬的程度对维持细胞内环境平衡起到不可忽视的作用，决定细胞的转归、恢复、修复、损伤、加重或死亡^[6]。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其激活后通过磷酸化其下游的靶蛋白，进而影响细胞自噬进程，在中枢神经系统疾病中发挥重要作用 ^[7]。但BQ-123对SAH神经功能损伤的保护作用是否与mTOR自噬通路的活化有关，目前报道较少。本研究建立大鼠SAH动物模型，应用不同剂量BQ-123进行干预，观察其对海马区磷酸化mTOR、自噬关键因子beclin-1和微管相关蛋白1轻链(LC3)-Ⅱ(二者是自噬过程中特异因子，可提示自噬发生发展的程度)以及大鼠神经功能的影响，探讨BQ-123对SAH的治疗机制。

清洁级雄性SD大鼠120只，体质量350～450 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2009-003。Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪购自美国GENE公司。兔抗mTOR抗体、兔抗beclin-1抗体和兔抗LC3-Ⅱ抗体购自北京博奥森生物技术公司。mTOR引物、beclin-1和LC3-Ⅱ引物购自美国Invitrogen公司。

采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、SAH模型组(SAH组)、 低(50 μg·kg^-1)和高剂量 (75 μg·kg^-1) BQ-123组。每组分为6、24、72和144 h4个时间点亚组。

参照文献^[8]，采用经典的自体血二次枕大池注血法(间隔48 h分别向枕大池注射自体动脉血0.3 mL)制备大鼠SAH的模型。假手术组大鼠于枕大池二次注入0.3 mL生理盐水，其他操作均与SAH组一致。低和高剂量BQ-123组在模型制备前30 min尾静脉注射BQ-123(将BQ123用生理盐水按10 mg·L^-1稀释，低和高剂量组分别每次给予50和75 μg·kg^-1)，然后再制备SAH模型。48 h后重复给药1次。

模型制备成功判定标准：① 行二次枕大池注血时，可见少量血性脑脊液在穿刺部位渗出，此现象充分说明穿刺针位置准确；② 剥离脑部时肉眼可以见到极其显眼的血性液体散在分布在脑底基底池部位。模型制作过程中，SAH组死亡7只，1只模型不符合标准被剔除；低和高剂量BQ-123组分别死亡6只，各组有1只模型不符合标准被剔除。最终纳入研究的大鼠：假手术组24只，SAH组24只， 低和高剂量BQ-123组分别为25只。

①学习能力评测：采用ZH-CSC型穿梭实验视频分析系统(shuttle box system)分别测定动物行为学能力。将各组大鼠按时间点分别放入穿梭箱，给予铃声刺激5 s，继之给予电击20 s，间隔10 s后进入下一轮训练。训练中，如果在铃声刺激5 s内大鼠逃向安全区，则为主动回避反应阳性；如果在铃声刺激5 s内大鼠未逃向安全区，则给予1.5 mA交流电20 s，如果在电击后逃向安全区，则为被动回避反应阳性，否则为主动、被动回避反应阴性。每只大鼠电击30次，记录被动回避潜伏期(passive avoidance latency,PAL)和主动回避反应次数等参数。主动回避反应次数占总训练次数的百分比即为主动回避反应率(active avoidance reaction rate,AARR)，用%表示；AARR越高，PAL越短，表明动物学习能力越强。 ②抓力实验：将大鼠放置于抓力测试仪恰当位置，用脚踩下踏板将显示器读数归零，用手拉住鼠尾向后下方施加轻微力量，待大鼠握紧抓力杆时，继续增加力道，直至大鼠肢体无法抵抗外力且听到“滴”的响声时，记录数值为本次拉力值。每只大鼠行3次测试，大鼠中间需休息5 min，取平均值作为最终结果，单位是牛顿(N)。

每组各时间点取3只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，取脑，截取视交叉平面至大脑横裂脑组织。石蜡包埋，冠状切片，片厚5 μm，HE染色，光学显微镜下观察。在有测微尺的光学显微镜(×400)下观察海马组织CA1区神经元形态变化并计数该视野下的存活神经元数量(有明显胞膜、胞核和核仁者为存活神经细胞)。具体方法：将CA1区平均分为3个等份，每个等份选取一个相同部位，应用Motic-6.0图像采集及图像分析系统分别计数其中每个视野(×200)下存活神经元数量，以每个视野下平均神经细胞存活率(400倍下CA1区存活细胞数量与总细胞数量比值)表示。

免疫组织化学法：标本采集同HE染色，切片常规脱蜡至去离子水，滴加复合消化液后加入37℃温箱孵育20 min，经PBS洗涤3 次，每次5 min，入3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15 min，经PBS洗涤后滴加兔抗鼠磷酸化mTOR、beclin-1和 LC3-Ⅱ多克隆抗体(1∶300、1∶250和1∶250)，4℃过夜；37℃复温45 min，PBS洗涤后滴加生物素化二抗，37℃、40 min，PBS洗涤；DAB显色，苏木精轻度复染，脱水透明，封片，镜下观察并摄片。阳性细胞计数：显微镜观察采用阳性细胞计数法，每只大鼠每个指标选3张脑切片，每张切片在高倍视野镜下随机选择5个不重叠视野(×400)，经Olymapus BHS显微镜观察并计算每个视野的阳性细胞数。结果判断以胞核呈棕黄色为阳性结果。

RT-PCR法：各组各时间点取3只大鼠,致死后迅速取双侧海马区组织，称量0.6 g,加入1 mL RNAiso Plus溶液后匀浆；室温静置5 min后12 000 r·min^-1、4℃离心5 min，取上清移至新的1.5 mL离心管内，加入1/5 RNAiso Plus溶液体积的氯仿；震荡混匀后室温静置5 min， 12 000 r·min^-1、4℃离心15 min，将上清液转移至新离心管中，加入0.5~1.0倍RNAiso Plus溶液体积的异丙醇；室温静置10 min，12 000 r·min^-1、4℃离心10 min，弃掉上清液，用与RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀；7 500 r·min^-1、4℃离心5 min，弃上清保留沉淀，干燥(不可加热)，溶解于30 μL DEPC处理水中；测量吸光度[A(260/280)]值，根据A(260)计算RNA浓度，-80℃保存。检测步骤：① m-TOR引物，上游引物5′-GGTGGACGAGCTCTTTGTCA-3′，下游引物5′-AGGAGCCCTAACACTCGGAT-3′；② beclin-1引物，上游引物5′-CTCTCGTCAAGGCGTCACTTC-3′，下游引物5′-CCTTAGACCCCTCCATTCCTCA-3′；③ LC3-Ⅱ引物，上游引物5′-ACCCTCTACGATGCTGGTGA-3′，下游引物5′-GCTGTCCTCAATGTCCTTCTG-3′。引物由上海生工生物技术有限公司合成。 反转录反应：42℃、50 min，95℃、10 s；PCR反应：95℃、5 s，60℃、31 s，40个循环；融解曲线分析。采用实时定量PCR检测磷酸化mTOR、beclin-1和LC3-Ⅱ mRNAs的表达，以GAPDH为内参基因，以Sham组mRNA表达水平为1，计算各组mRNA Ct值，按公式(ΔCt ＝目的基因平均Ct值 - 管家基因平均Ct值，ΔΔCt ＝实验组ΔCt -对照组ΔCt，相对表达水平 ＝ 2 ^-ΔΔCt)得出各组磷酸化的3种基因mRNA相对表达水平。

应用SPSS17.0 统计分析软件进行统计学处理。神经功能评测中AARR、PAL、抓力试验拉力值，存活神经元细胞率，mTOR、beclin-1和LC3-Ⅱ免疫组织化学和PCR检测结果均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

假手术组大鼠海马区神经细胞排列整齐、形态结构正常，神经元胞体较大，胞核大而圆，核仁清晰。SAH组大鼠海马区可见神经细胞变性水肿，细胞轮廓模糊，也可见死亡神经细胞，表现为细胞核溶解、核碎裂或核消失结构不清；与假手术组比较，SAH组大鼠各时间点细胞存活率均明显降低(P＜0.05)。BQ-123组神经细胞形态结构基本正常，视野中存活神经细胞增多；与SAH组比较，BQ-123组大鼠各时间点 细胞存活率均明显升高(P＜0.05)，高剂量BQ-123组较低剂量BQ-123组更为明显(P＜0.05)。见图 1(插页三)和表 1。

① 穿梭实验：与假手术组比较，SAH组大鼠对刺激反应迟钝，AARR减少、PAL延长(P＜0.05)。与SAH组比较，BQ-123组大鼠对刺激反应灵敏，AARR增多、PAL缩短(P＜0.05)；与低剂量BQ-123组比较，高剂量BQ-123组上述变化更为明显 (P＜0.05)。见表 2和3；② 抓力实验：与假手术组比较，SAH组大鼠各时间点抓力测定分值显著降低，其中6 h拉力值最低(P＜0.05)。与SAH组比较，BQ-123组大鼠各时间点分值有所升高(P＜0.05)；与低剂量BQ-123组比较，高剂量BQ-123组上述变化更为明显 (P＜0.05)。见表 4。

免疫组织化学法：磷酸化mTOR、beclin-1和LC3-Ⅱ阳性表达主要位于胞核，阳性胞核可见细小的棕黄色颗粒。假手术组大鼠海马组织中可见少量磷酸化mTOR、beclin-1和LC3-Ⅱ阳性细胞，染色棕黄。与假手术组比较，SAH 组各时间点大鼠海马组织中磷酸化mTOR、beclin-1和LC3-Ⅱ免疫阳性反应增强；与SAH 组比较，BQ-123组大鼠海马组织中磷酸化mTOR免疫阳性反应降低，beclin-1和LC3-Ⅱ免疫阳性反应进一步增强 。见图 2(插页三)。

RT-PCR法：与假手术组比较，SAH 组各时间点磷酸化mTOR、beclin-1和LC3-Ⅱ mRNA表达水平增高，其中磷酸化mTOR mRNA在24 h达高峰，持续至72 h仍有较高水平表达；而磷酸化beclin-1和LC3-Ⅱ mRNA表达水平于24 h达高峰后，72 h迅速下降，但仍高于假手术组(P＜0.05)；与SAH 组比较，各时间点BQ-123组大鼠海马组织中磷酸化mTOR mRNA表达水平降低，磷酸化beclin-1和LC3-ⅡmRNA表达水平增强，且二者高表达状态持续至72 h，与低剂量BQ-123组比较，高剂量BQ-123组上述变化 更为明显 (P＜0.05)。见表 5~7。

SAH可引发神经细胞丢失，研究^[9]表明：SAH造成的神经功能缺陷与神经细胞丢失 有关联，SAH后的功能恢复在很大程度上依赖于促进残存神经元的存活和抑制神经细胞凋亡。杨鹏等^[10]研究显示：对SAH大鼠采用氨基胍干预，可抑制海马区神经细胞凋亡，大鼠神经行为学功能得到一定的改善。BQ-123是一类高特异性亲和力及水溶性的内皮素受体拮抗剂，其特有的环五肽化学结构(D-Asp-L-Pro-D-Val-DTrp)使其在 体内生物半衰期短，代谢快。药理学研究^[11]显示：BQ-123可与内皮 素A受体(endothelin A receptor，ETA)结合，抑制血管的痉挛，改善脑组织灌注压，保证脑组织的血供，使细胞的缺血缺氧得到相应的改善，缓解脑组织的缺血缺氧，使神经细胞得到保护。本研究形态学结果显示：BQ-123组海马神经细胞存活比率改善，动物学习能力和运动的耐力有明显恢复趋势，说明BQ-123对SAH导致神经损伤有较好的防治作用。与国外Josko^[12]和Itoh等^[13]的研究结果基本一致。

自噬是真核细胞中广泛存在的细胞防御机制之一，自噬启动后对变形、衰老或损伤的蛋白质和细胞器进行识别、消化降解，以达到稳定细胞内环境，提高神经元的活性^[14]。Zhao等^[15]通过改良的颅内动脉穿刺法建立SAH模型，证实应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可抑制自噬的发生，引起脑组织含水量和血脑屏障渗透率进一步增加及神经细胞凋亡，神经功能评分下降。李建柯等^[16]采用视交叉池注血法制备SAH模型，应用自噬激活剂激活自噬，可降低脑损伤相关指标的表达，而抑制自噬的发生则可能加重脑组织损害。本研究中BQ-123组beclin-1和LC3-Ⅱ mRNA不仅表达水平较SAH组显著升高，二者高表达状态持续至72 h，且上述指标在高剂量BQ-123组变化更为明显；结合动物神经功能测试指标AARR增多、PAL缩短及拉力值增加等变化，说明BQ-123改善SAH造成的神经功能缺陷与调控自噬有关。本文作者认为：在BQ-123的干预下，脑供血得到改善，细胞低氧、氧自由基和ATP耗竭等各种因素缓解^[17]，使自噬过程或程度增加，丢失的神经细胞明显减少，神经功能显著恢复。

研究^[18]显示：自噬的激活是mTOR信号通路依赖的。 事实上，SAH模型脑组织mTOR活性显著升高^[18-19] ；徐祥^[20]采用SD大鼠建立SAH动物模型，同时采用雷帕霉素进行干预，通过免疫印迹法检测磷酸化mTOR的表达，结果显示：SAH后mTOR活性增加，微量雷帕霉素可降低mTOR蛋白磷酸化水平，减轻脑组织水肿和坏死。刘琨等^[21]研究表明：七氟醚预处理通过激活磷酸酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路，增强下游mTOR活性，降低缺血再灌注期间心肌细胞的自噬水平，从而发挥心肌保护作用。宫利等^[22]采用SD大鼠建立局灶性脑缺血模型发现：抑制mTOR 信号通路后，自噬水平亦发生相应变化，大鼠脑梗死面积增大。本研究中BQ-123组大鼠海马组织中mTOR活性显著降低，而beclin-1和LC3-Ⅱ mRNA表达水平增高，三者变化均与BQ-123剂量密切相关，说明BQ-123通过抑制mTOR活性，提高SAH后自噬程度，发挥神经保护作用。目前关于BQ-123调节mTOR信号活性的原因尚未明确。但研究^[23]显示：BQ-123可增加组织中内源性一氧化氮(NO)含量，减轻钙离子超载、维持微环境稳定，这些因素的变化可使mTOR上游的PI3K/Akt途径活化，可能是BQ-123提高mTOR信号活性的原因之一。

综上所述，BQ-123可减轻大鼠SAH后脑组织神经细胞的丢失，促进伤后神经功能的恢复；同时BQ-123可部分抑制SAH后mTOR活性，提高自噬程度。本研究结果为临床救治SAH提供了新思路，亦为BQ-123在临床的应用提供了理论基础。