吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (05): 905-909

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李俊, 代留玲, 李晔, 茶春丽
LI Jun, DAI Liulin, LI Ye, CHA Chunli
miR-221对糖尿病肾病小鼠胰岛β细胞功能的保护作用及其机制
Protective effect of miR-221 on β cells in mice with diabetic nephropathy and its mechanism
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(05): 905-909
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(05): 905-909
10.13481/j.1671-587x.20160513

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收稿日期: 2015-09-17
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李俊, 代留玲, 李晔, 茶春丽. miR-221对糖尿病肾病小鼠胰岛β细胞功能的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(05): 905-909.
LI Jun, DAI Liulin, LI Ye, CHA Chunli. Protective effect of miR-221 on β cells in mice with diabetic nephropathy and its mechanism[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(05): 905-909.
miR-221对糖尿病肾病小鼠胰岛β细胞功能的保护作用及其机制
李俊, 代留玲, 李晔, 茶春丽     
昆明医科大学第一附属医院肾内科, 云南 昆明 650032
收稿日期: 2015-09-17
基金项目: 云南省科技厅应用基础研究计划项目资助课题（2012FB029）；云南省教育厅资助项目资助课题（2014J040）
通信作者: 李俊(1968-),女,白族,云南省大理市人,主任医师,医学硕士,主要从事肾纤维化临床与基础方面的研究,主任医师,硕士研究生导师(Tel:0871-65324888-2528,E-mail:dllijun1968@163.com)
[摘要]: 目的: 研究miR-221对糖尿病肾病（DN）小鼠胰岛β细胞功能的影响，阐明miR-221在DN中的保护作用机制。 方法: 8周龄野生型雄性C57BL/6J小鼠20只随机分成对照组和DN组，每组10只，对照组小鼠给予正常饮食，DN组小鼠给予高脂饮食，并注射100 mg·kg-1链脲佐菌素（STZ）诱导部分胰岛素缺陷，对照组小鼠注射同体积柠檬酸缓冲液。之后DN组继续给予高脂饮食，对照组给予正常饮食，饲养10周后收集小鼠血液和尿液，检测血糖、血肌酐、血尿素氮浓度和24 h尿白蛋白排泄率等生理参数。在DN组小鼠中分离得到胰岛细胞。利用Real-time PCR检测胰岛细胞中SOCS3 mRNA表达水平，采用MTT法检测胰岛细胞增殖情况，ELISA法检测胰岛细胞中胰岛素含量和胰岛素的释放水平，荧光素酶报告基因法检测SOCS3活性荧光酶素报告基因活性。 结果: 成功构建DN小鼠模型。DN组小鼠的血糖、血肌酐、血尿素氮浓度和24h尿白蛋白排泄率均高于对照组（P<0.05）。过表达miR-221后，DN组小鼠胰岛细胞中SOCS3 mRNA表达水平低于正常胰岛细胞（P<0.05），过表达miR-221后胰岛细胞的增殖能力低于正常胰岛细胞（P<0.05），荧光素酶报告基因法确定SOCS3为miR-221下游靶基因。过表达miR-221后，胰岛细胞中胰岛素质量分数和胰岛素释放水平均高于正常胰岛细胞（P<0.05）。 结论: miR-221通过下调SOCS3水平促进胰岛细胞合成和分泌胰岛素的功能，改善DN小鼠中胰岛细胞的功能障碍。
关键词： 糖尿病肾病     miR-221     细胞因子信号抑制因子 3     胰岛β细胞    
Protective effect of miR-221 on β cells in mice with diabetic nephropathy and its mechanism
LI Jun, DAI Liulin, LI Ye, CHA Chunli     
Department of Internal Medicine, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University, Kunming 650032, China
[Abstract]: Objective: To study the influence of miR-221 in the β cells of mice with diabetic nephropathy (DN), and to clarify the protective effect of miR-221 on DN. Methods: Twenty wild type C57BL/6J mice aged 8 weeks were divided into control group and DN group(n=10).The DN mice models were constructed with 14 weeks of high fat diet,and 100mg·kg-1 streptozotocin (STZ) was used to induce the partial insulin deficiency. 10 weeks later the blood glucose, serum creatinine, blood urea nitrogen content and 24h-urinary albumin excretion rate were detected. The β cells of islet were isolated from the DN mice. The expression level of SOCS3 mRNA in β cells of islet was valued by Real-time PCR. The proliferation of pancreatic β cells of islet was examined by MTT assay. The contents of insulin and insulin release levels in pancreatic β cells of islet were detected by ELISA assay. Luciferase reporter gene assay was used to detect the luciferase reporter gene activity of SOCS3. Results: The DN mouse models were constructed successfully. The blood glucose, serum creatinine, blood urea nitrogen and 24h-urinary albumin excretion rate of the mice in DNA group were higher than those in control group(P<0.05). After overexpression of miR-221, the expression level of SOCS3 mRNA in pancreatic β cells of islet and the proliferation ability of β cells of islet of the mice in DN group were lower than those of normal islet cells (P<0.05). Then luciferase reporter gene method found SOCS3 as one of the target genes of miR-221. After overexpression of miR-221, the insulin release level and insulin content in pancreatic β cells of islet were higher than those of normal islet cells(P<0.05). Conclusion: miR-221 can promopt the synthesis and secretion of β cells of islet and inhibit the dysfunction of β cells of islet in the DN mice by down-regulating the SOCS3 level.
Key words: diabetic nephropathy     miR-221     suppressor of cytokine signaling 3     β cells of islet    

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已经成为一种世界范围内危害公众健康最为严重的疾病，其中又以2型糖尿病更为普遍。糖尿病患者终末期常出现的主要并发症之一，即糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)，DN可引发肾小球基底膜增厚、肾小管硬化和肾间质纤维化等病变，最终引发患者肾衰竭并导致死亡，严重影响糖尿病患者生存[1-2]。胰岛β细胞的功能障碍是引发2型糖尿病的关键因素，可造成周围组织胰岛素抵抗、肝脏葡萄糖生成增加和胰岛素分泌减少等代谢障碍，改善DN患者的胰岛β细胞障碍对提高患者生存率具有重要意义[3]。JAK/STAT是调节胰岛β细胞功能的重要信号通路之一，而细胞因子信号抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCs)家族是可反馈性阻断JAK/STAT的负性调节因子，在2型糖尿病存在异常表达，SOCS3蛋白的调节机制可能是缓解胰岛β细胞障碍的关键[4-5]。微小RNA(microRNA，miRNA) 是一类进化保守、长度为15~22 bp的非编码调控单链小分子RNA，在糖尿病中的调控作用也越来越受到人们的重视[6]。 经生物信息学预测，SOCs家族成员SOCS3是miR-221调控的下游靶基因之一,但目前尚无关于该机制在DN中作用的研究[7]，因此本文作者主要研究miR-221对胰岛β细胞功能的影响及机制，为DN的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 DN小鼠模型的构建

选用8周龄野生型雄性C57BL/6J小鼠20只，随机分成2组，对照组小鼠给予正常饮食，糖尿病肾病组(DN组)小鼠给予高脂饮食。饲养4周后，DN组小鼠给予一次性腹腔注射100 mg·kg-1溶于pH4.45柠檬酸缓冲液的链脲佐菌素 (streptozotocin,STZ) 诱导部分胰岛素缺陷，对照组小鼠注射同体积0.1mL·10 g-1体质量柠檬酸缓冲液。之后DN组小鼠继续给予高脂饮食，对照组小鼠给予正常饮食，饲养10周。小鼠于本院动物房普通鼠笼饲养，温度恒定，饮水高温消毒，食物、环境紫外灯消毒，保证无菌干爽的饲养环境。STZ注射10周后收集代谢笼24h尿液，检测尿白蛋白水平，计算24 h尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)。禁食8h后，收集尾静脉血，应用血糖仪测定血糖(blood glucose，BG)、血肌酐(serum creatinine，Scr)和血尿素氮 (blood ureanitrogen，BUN) 水平。血糖高于16 mmol·L-1被认为糖尿病动物模型成功，同时24 h-UAER阳性认为DN模型建立成功。

1.2 胰岛细胞分离、培养与转染

采用胆总管胶原酶灌注消化胰腺后梯度分离的方法分离胰岛，用1 mL 0.25%胰酶混悬消化，用移液枪反复吹打至镜检呈单细胞，无细胞团。加入1mL DMEM培养基终止消化，1 000 r·min-1离心4 min，弃上清。重新接种到60 mm培养板中，加入10mL DMEM/FBS培养基培养用于后续实验。转染时，将细胞提前24 h接种于35 mm培养板中，培养至对数生长期，利用Lip2000分别转染miR-221 mimics和NC oligo。转染过程根据上海吉玛基因公司Lip2000试剂盒说明书操作。

1.3 Real-time PCR法检测miR-221和SOCS3 mRNA表达水平

收集转染有miR-221 mimics和NC oligo的胰岛细胞，利用TRIzol-总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，计算RNA浓度。根据PrimeScript RT reagent kit Perfect Real-Time 试剂盒说明书对mRNA进行反转录，得到cDNA用于Real-time PCR实验。利用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒检测miR-221(5′-AGCTACATTGTCTGCTGG-3′和5′-GTATCCAGTGCAGGGT-CC-3′)、SOCS3 mRNA(5′-GGAGTTCCTGGACCAGTACG-3′和 5′-TTCTTGTGCTTGTGCCATGT-3′)表达。扩增反应条件：90℃、5 s，58℃、20 s，72℃、30 s,45个循环。荧光获取程序按照默认程序进行。采用2－△△Ct法计算mRNA表达水平。

1.4 荧光素酶报告基因法检测SOCS3荧光素酶报告基因活性

PCR合成人源SOCS3基因的3’ UTR区域的DNA片段，连接到pmiR-RB-REPORT质粒中，构建SOCS3报告基因质粒。送至上海生工生物有限公司测序鉴定。在293T细胞中转染pmiR-RB-REPORT-SOCS3和miR-221，以转染pmiR-RB-REPORT-SOCS3质粒和NC oligo为对照，pGL3质粒用于评估荧光素酶信号强弱，代表荧光素酶报告基因活性。

1.5 MTT法检测胰岛细胞增殖活性

将转染有miR-221 mimics和NC oligo的胰岛细胞重新接种到96孔板中，每孔1×104个细胞，设置4个平行样。分别于5% CO2、37℃孵育1~5d后，每孔加入10 μL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育2h。检测在450 nm处各孔的吸光度(A)值，代表胰岛细胞的增殖活性。

1.6 胰岛素释放水平和胰岛素水平检测

分离得到的胰岛细胞接种于24孔板中，分别转染miR-221 mimics和NC oligo后，PBS洗3次，用500 μL含2.8 mmol·L-1葡萄糖的KRB缓冲液处理60 min，然后用500 μL含20 mmol·L-1葡萄糖的KRB缓冲液处理45min，37℃。小心去上清后，1 000 r·min-1、4℃离心4 min，收集上清保存于－80℃冰箱。ELISA试剂盒鉴定胰岛素释放量。平行细胞样中加入100 μL细胞裂解液，BCA法测定总蛋白含量。利用含0.18mmol·L-1 HCl的95%乙醇过夜处理提取总细胞胰岛素，ELISA测定胰岛素浓度。根据公式计算细胞内胰岛素含量，细胞内胰岛素含量=总细胞胰岛素含量/细胞总蛋白含量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。血糖、血肌酐、血尿素氮水平和24 h-UAER等以x±s表示，2组样本均数比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 DN小鼠模型的生理指标

构建DN小鼠模型后检测结果显示:DN组小鼠外周血中BG、Scr、BUN水平和24h-UAER均高于对照组(P<0.05)，表明成功构建DN小鼠模型。

表 1　2组小鼠BG、Scr、BUN和24h-UAER Table 1　BG,Scr,BUN,and 24 h-URER of mice in various groups
(n=10,x±s,η)
Group BG[cB/(mmol·L-1)]Scr[cB/(μmol·L-1)]BUN[cB/(mmol·L-1)]24h-UAER(μg·24 h-1)
Control 7.81±0.9824.39±2.9313.26±2.959.35±1.32
DN 19.76±2.73*42.65±3.74*236.16±36.48*14.62±1.78*
*P<0.05 compared with control group.
表选项
2.2 Real-time

PCR 法检测DN组小鼠胰岛细胞中miR-221和SOCS3 mRNA表达水平 分离得到DN小鼠胰岛细胞后，通过Real-time PCR法检测分离得到的胰岛细胞中miR-221和SOCS3 mRNA表达水平结果显示：过表达miR-221后，miR-221水平有所升高，表明成功将miR-221转入胰岛细胞中。同时，DN组小鼠胰岛细胞中SOCS3 mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)，表明miR-221抑制胰岛细胞中SOCS3 mRNA水平。

2.3 SOCS3荧光素酶报告基因活性

通过荧光素酶报告基因法检测miR-221和SOCS3间的关系，结果显示：在加入miR-221时，SOCS3荧光素酶报告基因活性低于对照组(57.24±0.02)，说明miR-221明显抑制SOCS3报告基因的活性，SOCS3为miR-221的下游靶基因。 利用MTT法检测miR-221对分离得到的胰岛细胞增殖活性的作用：过表达miR-221后，胰岛细胞在450nm处的A值高于对照组(P<0.05)，说明miR-221可使胰岛细胞增殖活性升高。见表 3。

表 2　2组小鼠胰岛细胞中miR-221和SOCS3 mRNA表达水平 Table 2　Expression levels of miR-221 and SOCS3 mRNA in islet cells of mice in various groups
(n=10,x±s,η)
Group miR-221 mRNASOCS3 mRNA
Control 3.25±0.117.44±0.06
DN 6.24±0.15*3.27±0.05*
*P<0.05 compared with control group.
表选项
表 3　2组小鼠胰岛细胞的增殖活性 Table 3　Proliferation activities of islet cells of mice in various groups
GroupA value
(t/d) 12345
Control 1.5432.5563.9175.4865.641
miR-221 1.5142.1272.6483.7424.225P<0.05
表选项
2.5 胰岛细胞中胰岛素和胰岛素释放水平

在分离得到的胰岛细胞中进行葡萄糖处理，检测胰岛素水平与胰岛素分泌的改变：转染miR-221后，胰岛细胞中胰岛素质量分数[(1.72±0.02) mg·g-1 蛋白)高于对照组［(0.98±0.01) mg·g-1蛋白, t=2.13,P<0.05]，细胞培养上清中胰岛素水平[(0.42±0.02) mg·g-1 蛋白]高于对照组[(0.27±0.01) mg·g-1蛋白,t=2.13,P<0.05]。表明miR-221过表达可诱导胰岛细胞合成和分泌胰岛素。

3 讨 论

糖尿病主要有1型和2型，其中以2型糖尿病为主,胰岛β细胞的功能障碍是引发糖尿病的直接因素。1型糖尿病多因自身免疫攻击破坏和先天易感因素导致胰岛细胞的丢失，引起体内胰岛素水平不足而诱发糖尿病。2型糖尿病主要是胰岛素抵抗和胰岛细胞功能障碍造成的。然而，目前研究显示：糖尿病患者体内血糖、激素和细胞因子等物质的积累或失调又将进一步对胰岛细胞的增殖和功能造成损伤[8-9]。

DN是糖尿病在终末期常出现的严重并发症，是一种严重的微血管病变，可引起患者肾功能衰竭并导致死亡 [10-11]。在该过程中，胰岛细胞的增殖、凋亡与功能损伤情况的相关研究仍较少。因此本研究中成功构建了DN小鼠模型，通过对小鼠的生理特征检测发现：所构建DN小鼠确实存在高血糖和尿蛋白阳性的特征。

miRNA在糖尿病患者中存在异常表达，通过调节胰岛β细胞的功能,影响糖尿病的病程发展与治疗效果。其中miR-375通过控制肌营养素水平和PI3激酶信号级联通路下调胰岛素的分泌作用。miR-9和miR-124a也可以抑制葡萄糖刺激引起的胰岛细胞分泌胰岛素功能[12-13]。在纤维化肾脏中，可以检测到miR-192表达上调，Chung等[14]研究认为：miR-192是TGF/Smad3途径介导肾纤维化的重要调控因子。miR-200家族也通过调节肾小管上皮细胞的上皮-间质样细胞转化影响肾脏纤维化[15]。miR-221在多种癌症和疾病中存在异常表达，并且参与调节细胞形态变化，通过对miR-221下游靶基因的预测分析发现：miR-221潜在的下游靶基因中也存在与胰岛素分泌相关的多种蛋白，但miR-221在胰岛细胞中的功能尚不明了。

SOCS3是细胞因子信号抑制因子家族成员之一，可以通过调节JAK/STAT通路调节胰岛β细胞功能，也可以负调控TNF及瘦素的表达，从而抑制胰岛素相关信号转导，增强周围组织的胰岛素抵抗。此外SOCS3也参与促进胰岛细胞的凋亡与抑制胰岛细胞增殖[7]。SOCS3被预测为miR-221的下游靶基因之一，然而二者之间的关系和功能尚无相关研究。因此本研究利用荧光素酶报告基因实验结果显示：SOCS3为miR-221下游靶基因之一，且在DN小鼠分离得到胰岛细胞中过表达miR-221可以抑制SOCS3基因的表达。同时，过表达miR-221可以抑制胰岛细胞的增殖，并且促进胰岛细胞中胰岛素水平和胰岛素分泌的增加，这与SOCS3水平降低的效果一致，因此miR-221在糖尿病中的功能可能是通过SOCS3实现的。

综上所述，SOCS3可能为miR-221的下游靶基因之一，且miR-221通过下调SOCS3水平，促进胰岛细胞合成和分泌胰岛素的功能，减轻DN小鼠胰岛细胞的功能障碍。

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