随着手术和化疗等治疗方法的综合应用，卵巢癌患者的病死率已显著降低，但由于卵巢癌的易复发、易转移及多药耐药等特点，目前世界上每年仍有约14万患者死于卵巢上皮性癌^[1-3]，因此，寻找更加有效的针对卵巢上皮性癌的分子靶向及免疫治疗方法已成为目前研究的热点之一。γδT细胞具有天然的免疫特点，在抗感染及抗肿瘤方面起到关键的作用，具备免疫监视及肿瘤杀伤的功能^[4]，近年来对γδT细胞的研究逐渐增多。有研究^[5-7]表明：γδT细胞对宫颈癌和结肠癌等多种人类恶性肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，但有关γδT细胞对卵巢癌细胞增殖的抑制作用研究甚少。本研究拟通过观察卵巢癌SKOV3细胞的增殖能力及其迁移能力，探讨γδT细胞对卵巢癌细胞增殖能力的抑制作用，为其更好地应用于临床提供依据。

SKOV3细胞由本课题组自存。胰蛋白酶、RPMI 1640培养基和胎牛血清等均购美国Invitrogen Gibco公司。MTT及酶标仪购自美国Sigma公司，Transwell小室购于美国Corning公司，MCO18AIC恒温培养箱购自日本三洋公司，FV1000激光共聚焦显微镜及流式细胞仪购自日本奥林巴斯公司。

分离人外周血单个核细胞，在RPMI 1640培养基中培养成细胞悬液，调整细胞浓度，加入96孔板内，收集培养10~15 d的细胞，按照文献^[8-9]的方法进行检测，获取γδT细胞，用流式细胞仪检测细胞纯度，纯度大于70%用于后续实验。将卵巢癌SKOV3细胞复苏后，用含10%的胎牛血清的细胞培养基进行培养，置于恒温培养箱内传代培养24 h，作为对照组待用。将获取的悬浮γδT细胞加入培养24 h的卵巢癌SKOV3细胞中继续共培养72 h，作为γδT细胞处理组。

2组细胞培养24 h后，分别制备细胞爬片，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS再次洗涤3次，结晶紫染色5 min，PBS洗涤3次以上，甘油∶水=9∶1封片，显微镜下观察各组细胞形态表现。

将2组细胞分别以每孔5 000个细胞接种到96孔培养板中，培养24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，5%CO₂、37℃培养箱中继续培养4 h后终止培养，吸去孔内培养液，低速震荡10 min后，用酶标仪在570 nm波长处测定培养1～5d 各组样品的吸光度(A)值。细胞增殖抑制率=(1－处理组A值/对照组A值)×100%。实验重复3次。

选取对照组和γδT细胞处理组处于对数生长期的SKOV3细胞，用无血清的细胞培养基培养12 h，在胰蛋白酶作用下进行消化，制成密度为5×10⁵mL^-1的细胞悬液，选用8 μmol·L^-1的小室，上室加入100 μL的细胞悬液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养液，恒温培养箱内培养24 h后取出，棉签轻轻去除滤膜表面的细胞，用4%多聚甲醛在室温下固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤3次以上，显微镜下进行细胞计数。实验重复3次。

将2组细胞分别接种于96孔板，培养24 h后，取5×10⁵个细胞，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞及5 μL的Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL 7-ADD染液，室温孵育20 min后于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。实验重复3次，结果以细胞凋亡率表示。细胞凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组SKOV3细胞增殖抑制率、迁移率和凋亡率均以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2组细胞分别培养72 h后，置于激光共聚焦显微镜下观察：γδT细胞处理组卵巢癌SKOV3细胞出现染色质浓缩、核染色增强、细胞碎片增多、凋亡小体出现等多种细胞凋亡的特征性表现；对照组SKOV3细胞形态表现变化不明显。见图 1。

图 1　2组细胞的形态表现(bar=20 μm) Figure 1　Morphological appearence of SKOV3 cells in two groups (bar=20 μm)

图选项

培养5d时，γδT细胞处理组SKOV3细胞增殖抑制率低于对照组(P<0.05)。见表 1。

γδT细胞处理组SKOV3细胞的穿膜细胞数明显少于对照组， γδT细胞处理组和对照组SKOV3细胞的迁移率分别为(9.7±7.6)%和(28.3±9.1)%(P<0.05)。见图 2(插页二)。

γδT细胞处理组SKOV3细胞凋亡率为(23.6±4.3)%，对照组SKOV3细胞凋亡率为(10.2±3.1)%，γδT细胞处理组SKOV3细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。

γδT细胞是一种具有与巨噬细胞、NK细胞等相似的免疫功能的细胞，在肿瘤免疫治疗方面起着重要的作用。γδT细胞主要分布在人体的上皮组织和黏膜组织中，黏膜组织中的γδT细胞可以调节局部和全身的免疫反应，而上皮组织中的γδT细胞可以与周围的上皮细胞相互作用调节IgA的产生，活化的γδT细胞能够利用FasL介导的及穿孔素或颗粒酶依赖的细胞毒通路作用于肿瘤细胞，导致细胞死亡^[10-11]。γδT细胞对抗原的识别无主要组织相容性复合体(MHC)限制性，具有其他细胞不具备的独有功能，在没有分子提呈的情况下识别抗原^[12-14]，可以通过细胞间的直接接触以及细胞分泌的相关因子完成免疫调节功能。研究^[15-17]显示：γδT 细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱。

本研究通过对卵巢癌SKOV3细胞与经过γδT细胞处理的SKOV细胞的增殖情况对比观察γδT细胞对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响，为进一步探讨γδT细胞导致肿瘤细胞凋亡的机制奠定基础，为其更好地应用于临床治疗卵巢癌提供理论依据。本研究中MTT法及Transwell小室法检测结果显示：经过γδT细胞处理后的卵巢癌细胞的增殖及迁移能力均明显下降；流式细胞术检测显示：经过γδT细胞处理后的卵巢癌细胞凋亡率增加，表明γδT细胞可抑制卵巢癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。

综上所述，γδT细胞能够抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖及迁移能力，可以作为细胞生物治疗的一种新的细胞，应用于复发的、难治的卵巢癌患者临床治疗，降低卵巢癌的复发率和致死率。