动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是严重危害人类健康的心血管疾病之一，是各种心血管疾病的病理基础，可引起急性冠状动脉综合征、急性心肌梗死甚至心源性猝死^[1-2]。细胞凋亡是As病变的主要特征之一，是As的独立危险因素。As斑块内细胞过度凋亡，促使不稳定性斑块形成^[3]。参红通络颗粒以国医大师任继学先生提出的“心病伏邪，蕴结成毒”的病因理论为指导，采用“益气安神、豁痰通络”的治疗方法^[4]。既往相关临床研究^[4-7]显示：参红通络颗粒具有减少心绞痛发作，降低心肌梗死再发率、心力衰竭患病率、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术后再狭窄发生率及减轻狭窄程度的作用，但上述研究仅限于参红通络颗粒治疗效果的临床观察，既往对参红通络颗粒治疗机制的研究报道^[8-9]仅有2篇，且研究对象、研究方法不尽一致，研究结果亦相差甚远，未能提供有说服力的研究数据，参红通络颗粒发挥作用的具体机制尚不明确。因此，本研究通过建立小鼠As模型，研究参红通络颗粒对As和斑块内细胞凋亡的影响及其抗动脉粥样硬化作用机制，以期为参红通络颗粒治疗As提供科学依据和数据支持，发挥祖国传统中医药在治疗As中的积极作用。

雄性6周龄无特异病原体(SPF)ApoE^-/-小鼠40只，体质量(20.0±0.5)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2014-0004。参红通络颗粒购自吉林省仙草医药有限公司，该药包括人参、丹参、红景天、水蛭和瓜蒌等8味中药，公司提供水煎浓缩至所需浓度，置于4℃冰箱储存。总胆固醇ELISA测试盒、甘油三酯ELISA测试盒、低密度脂蛋白胆固醇ELISA测试盒和高密度脂蛋白胆固醇ELISA测试盒购自南京建成生物工程研究所，纯化鼠抗Bax抗体和纯化鼠抗Bcl-2抗体购自美国BD公司，胆固醇、熊去氧胆酸和丙硫氧嘧啶购自国药集团化学试剂有限公司。水平离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)，石蜡切片机(美国Shandon公司)，普通光学显微镜和荧光显微镜(日本 Olympus公司),-80℃超低温冰箱和高压湿热灭菌锅(日本S anyo公司)，酶标仪(美国BIO-RAD公司)。

普通饲料购自长春鼎国生物技术有限公司；高脂饲料购自长春鼎国生物技术有限公司，各成分构成：1%胆固醇，8%牛油，7.5%蛋黄粉，83.5%普通饲料。熊去氧胆酸2 mg·kg^-1·d^-1和丙硫氧嘧啶4 mg·kg^-1·d^-1。

40只ApoE^-/-小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、模型组、低剂量中药治疗组和高剂量中药治疗组，每组10只。正常对照组喂饲普通饲料，其余3组喂饲高脂饲料，喂养4周后，除正常对照组外，其余3组各随机抽取1只小鼠，取主动脉弓，行HE染色，光镜下观察组织形态表现，3组小鼠主动脉弓内均有As斑块形成，证实造模成功。低和高剂量中药治疗组小鼠分别给予参红通络颗粒5.06和10.12 g·kg^-1·d^-1灌胃治疗，正常对照组和模型组小鼠给予等体积纯净水灌胃。继续喂养6周后，所有小鼠禁食12 h，20%氨基甲酸乙酯0.5 mL腹腔麻醉，摘眼球取血，3000 r min^-1离心10 min，分离血清，并将小鼠主动脉弓剥离、固定。

分离小鼠血清后，采用ELISA试剂盒分别检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。根据说明书操作。

取ApoE^-/-小鼠主动脉弓血管，经1%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，于光镜下观察斑块形态并拍照，并根据比例尺计算斑块面积及斑块占管腔百分比。

按TUNEL说明书操作。石蜡切片用二甲苯浸泡2次，每次5 min；梯度酒精脱蜡；PBS洗涤3次，每次5 min；加入蛋白酶K，37℃作用30 min；标本加适量标记缓冲液，放置5 min；加50 μL标记液于标本上，37℃反应；PBS洗涤3次，每次5 min；滴加50 μL工作液，37℃反应30 min；PBS洗涤3次，每次5 min；加入100 μL DAB工作液，孵育10 min，显色；TBS冲洗3次，每次3 min；0.5%甲基绿染色10 min；TBS冲洗3次，每次3 min；脱水、封片，显微镜下观察。正常细胞核呈绿色，凋亡细胞的固缩核呈棕黄色不规则颗粒状。检测小鼠主动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡数量，并计算凋亡指数。斑块内细胞凋亡指数＝凋亡细胞核数/(凋亡细胞核数＋正常心肌细胞核数)×100％。

操作步骤：玻片用4%多聚甲醛固定30 min；pH 7.4 PBS洗涤(3 min×3次，下同)；0.5%Triton X-100中孵育10 min；PBS洗涤；3%H₂O₂处理30 min；PBS洗涤；2%BSA-PBS室温下孵育30 min，PBS洗涤1次，滴加50 μL兔抗鼠多克隆抗体Bax(1∶200稀释)，4℃过夜，PBS冲洗后分别用羊抗兔IgG孵育30 min。采用DAB试剂盒，按说明书操作进行显色。PBS冲洗。苏木精复染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，封片，光学显微镜下观察。Bcl-2和Bax蛋白均在细胞胞浆中表达，呈棕黄色颗粒状，且颜色越深，表达越强。采用图像分析软件测定阳性产物灰度值进行定量分析。灰度值越高，阳性着色越浅，蛋白表达水平越低。

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。各组小鼠血脂水平、主动脉粥样硬化斑块面积及斑块内细胞凋亡指数以x±s表示，对于符合正态分布且总体方差齐的数据采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

与正常对照组比较，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较， 高剂量中药治疗组小鼠血清HDL-C水平明显升高(P<0.01)，TC、TG和LDL-C水平无明显变化(P>0.05)；与模型组比较，低剂量中药治疗组小鼠血清TG水平明显降低(P<0.05)，HDL-C水平明显升高(P<0.05)。与低剂量中药治疗组比较，高剂量中药治疗组TG和HDL-C水平均明显升高(P<0.05)。见表 1。

光镜下观察：正常对照组小鼠主动脉内皮细胞连续、完整，主动脉内膜光滑，未见泡沫细胞，无斑块形成。与正常对照组比较，模型组小鼠主动脉管腔内可见较大斑块，斑块面积为(307.26±89.82)μm²，向管腔内突出，其内可见泡沫细胞、胆固醇结晶和炎性细胞乱序排列，斑块处内膜不连续。与模型组比较，低剂量中药治疗组小鼠主动脉管腔内斑块略小，斑块面积为(197.39±56.25)μm²，胆固醇结晶较少；高剂量中药治疗组小鼠主动脉管腔内粥样斑块较小，斑块面积为(125.37±42.96)μm²，泡沫细胞、胆固醇结晶及炎性细胞均较少，斑块内膜连续。见图 1(插页一)。与模型组比较，低和高剂量中药治疗组小鼠主动脉粥样斑块面积均明显缩小(P<0.01)。

荧光显微镜下观察：正常对照组小鼠主动脉管腔内未见红色颗粒状凋亡细胞核存在；模型组小鼠主动脉管腔内可见大量红色颗粒状凋亡细胞核，细胞凋亡指数为(35.62±4.25)%，分布范围与斑块大小一致；低剂量中药治疗组小鼠主动脉管腔内出现较多凋亡细胞核，凋亡指数为(31.16±3.56)%；高剂量中药治疗组小鼠主动脉管腔内有少量红色颗粒状凋亡细胞核存在，凋亡指数为(26.75±3.42)%。与模型组比较，低和高剂量中药治疗组小鼠主动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡指数均明显降低(P<0.01)。

模型组、低和高剂量中药治疗组小鼠主动脉粥样硬化斑块内均可见棕黄色Bcl-2和Bax阳性表达。与模型组比较，低和高剂量中药治疗组小鼠主动脉粥样硬化斑块内Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.01)；与低剂量中药治疗组比较，高剂量中药治疗组小鼠动脉粥样硬化斑块内Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.01)，Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。见图 2和3(插页二)及表 2。

血脂异常在AS的发生发展过程中起重要作用，是冠心病的重要危险因素。其中，HDL-C具有对抗As、保护心血管系统的重要作用，这一点已成共识。脂质在血管壁的积聚是As的重要病理基础，而且脂质水平高低与As斑块的稳定性关系密切，脂质水平高的斑块稳定性差，容易发生破裂，引起急性心肌缺血、心肌梗死或猝死，对血脂水平的有效干预，可显著地降低心血管事件的风险^[10-12]。本研究结果显示：参红通络颗粒进行干预的小鼠血清HDL-C水平明显高于模型组，且随参红通络颗粒剂量的增加，HDL-C水平亦随之升高，并呈现一定的梯度变化。由此说明，参红通络颗粒可显著升高小鼠血清HDL-C水平，而升高的HDL可能通过逆向运输血液中的胆固醇及脂质，参与减少斑块内脂质沉积及缩小小鼠主动脉硬化斑块面积，从而有效抑制动脉管腔狭窄，并起到稳定斑块、减少斑块破裂风险的重要作用，进而减少急性心血管事件的发生。

细胞凋亡参与As的发生发展过程，斑块内细胞过度凋亡会使斑块不断增大并增加斑块致栓性。细胞凋亡的发生受凋亡相关基因的调控，其中，Bcl-2是抑制凋亡的关键分子，Bcl-2基因产物作为凋亡抑制蛋白参与细胞程序化死亡过程。Bax是重要的凋亡促进基因，Bcl-2和Bax在线粒体中构成异二聚体，Bcl-2与Bax蛋白表达水平决定细胞的命运，当Bcl-2表达水平高于Bax时，将形成异二聚体而抑制凋亡，当Bcl-2表达水平低于Bax时，细胞发生凋亡^[13-16]。参红通络颗粒在2008年纳入长春中医药大学的冠心病治疗方案，经临床观察发现：参红通络颗粒对冠心病治疗的有效率达90%，使心肌梗死和心绞痛再住院等心血管时间的发生率降低50%，提高了患者的生活质量。但既往研究主要集中于对参红通络颗粒药效的临床观察，而对参红通络颗粒抗As的具体机制研究甚少。为提高临床用药的科学性和针对性，本研究通过成功建立ApoE^-/-小鼠As模型，证实参红通络颗粒可通过上调Bcl-2蛋白表达水平、下调Bax蛋白表达水平，有效抑制小鼠主动脉粥样硬化斑块内细胞过度凋亡，起到稳定斑块的作用。本研究结果为进一步应用参红通络颗粒治疗As相关疾病提供了更有力的数据支持。