2016, Vol. 42扩展功能
文章信息
- 惠双, 郭宏强
- HUI Shuang, GUO Hongqiang
- DNA-PKcs介导多药耐药恶性胶质瘤细胞化疗抗性及分子机制
- Chemoresistance of multi-drug resistance malignant glioma cells mediated by DNA-PKcs and its molecular mechanism
- 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(05): 877-881
- Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(05): 877-881
- 10.13481/j.1671-587x.20160507
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-19
胶质瘤是最常见的脑部恶性肿瘤，起源于神经胶质细胞，其高增殖和侵袭行为导致其复发率居高不下，患者预后较差，中位存活时间低于1.5年[1]。多药耐药(multi-drug resistance,MDR)的产生是脑胶质瘤化疗失败的主要原因，随着化疗时间和次数的延长，MDR关联蛋白表达水平上调，导致多种化疗药物对胶质瘤的临床疗效不明显[2]。DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependent kinase,DNA-PK)的催化亚单位，与另外2个亚单位Ku70和Ku80 共同组成DNA-PK复合体，在DNA损伤的非同源末端连接修复中发挥关键作用[3]。DNA-PKcs在脑部肿瘤[4]、肺癌[5]和卵巢癌[6]等多种肿瘤细胞中呈现高表达，并且DNA-PKcs在脑部肿瘤的高表达与其侵袭能力和恶性程度呈正相关关系，这种高表达的生物学意义和机制值得深入研究。本研究采用siRNA技术建立DNA-PKcs表达敲除的MDR脑胶质瘤细胞株，拟探讨DNA-PKcs对脑胶质瘤化疗敏感性的影响及其分子机制。
1 材料与方法 1.1 细胞株和试剂胶质瘤细胞株U251及对多柔比星(ariamycin，ADM)耐药的U251细胞株购自美国国家癌症研究中心，由本室保存。胎牛血清和改良型RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自美国Sigma公司；ADM、紫杉醇(paclitaxel，PTX)和吉西他滨 (gemcitabine，GEM)购自上海威奥生物科技公司；CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒购自北京索莱宝生物科技公司；siRNA引物和pLKO.1-Puro质粒购自北京旷博生物技术有限公司；DNA-PKcs、MDR1 和pNF-κB/p65抗体购自上海铭睿生物科技有限公司；总Akt、pAkt/T308和pAKT/S473抗体购自南京凯基生物科技公司。
1.2 细胞培养及分组胶质瘤U251细胞培养于25 cm2细胞培养瓶中,每瓶加5 mL10%热灭活的胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、25 mg·L-1青霉素和50 U·mL-1链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2和100%饱和湿度的CO2培养箱中培养。当细胞融合达到80%以上，胰蛋白酶消化传代。分别培养3种细胞：胶质瘤细胞株U251(U251细胞)、ADM耐药细胞株(U251/ADM细胞)和DNA-PKcs基因表达沉默的ADM耐药的U251细胞(U251/ADM/SIDNA-PKcs细胞)。
1.3 siRNA靶序列设计及细胞筛选根据PubMed的GenBank数据库中DNA-PKcs基因的序列以及siRNA的设计原则，应用网站(http://www.genscript.com/)在线设计抑制DNA-PKcs基因表达的靶向siRNA序列(siDNA-PKcs)。正义链为 5′-GATCCCGGGCGCTAATCGTACTGAATTCAAGAGATTCAGTACGA-TTAGCGCCCTTTTTTGGAAA-3′，反义链为 3′-GGCCCGCGATTAGCATGACTTAAGTTCTCT-AAGTCATGCTAATCGCGGGAAAAAACCTT-TTCGA-5′，化学合成siDNA-PKcs克隆入pLKO.1 -Puro质粒中，交由上海生工公司鉴定。预先培养于75 cm2细胞培养瓶中，待80%细胞融合时，经Lipofectamine 2000介导siDNA-PKcs质粒转染U251细胞。转染48 h后使用潮霉素筛选阳性克隆，阳性克隆即DNA-PKcs基因表达沉默的ADM耐药的U251细胞，并扩大培养。
1.4 CCK8法测定药物敏感性收集对数生长期3组细胞，每孔200 μL分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种5×103个细胞，孵育24 h。孵育后，各组细胞分别加入不同浓度梯度的ADM(0.2、1.0、5.0、25.0、125.0和625.0 mg·L-1)、PTX(0.03、0.15、0.75、3.75、18.75和93.75 mg·L-1)、GEM(0.02、0.1、0.5、2.5、12.5和62.5 mg·-1)，每组设置3个重复孔，继续培养48 h。培养结束后每孔加入CCK8试剂10 μL，继续培养3 h，在酶标仪上测定450 nm波长处吸光度(A)值，抑制率=[(对照组A值－实验组A值)/对照组A值]×100%。以抑制率为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制抑制率-药物浓度曲线，根据回归方程计算半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration，IC50)值。
1.5 Westernblotting法检测蛋白表达水平 收集对数生长期3组细胞，磷酸盐缓冲液清洗2次，裂解液裂解细胞，12 000 r·min-1、4℃离心10 min得到上清液。处理后的上清液经考马斯亮蓝法定量，每次取15~20 μg蛋白上样，使用SDS-聚丙烯酰胺电泳分离得到蛋白条带，转移至硝酸纤维膜上。在室温条件下脱脂奶粉中封闭1~2 h，室温下与耦联辣根过氧化物酶的DNA-PKcs、MDR1、pNF-κB/p6、总Akt、pAkt/T308、pAKT/S473抗体孵育1 h。随后完成结合信号显影，凝胶成像系统分析实验结果。
1.6 统计学分析采用SPSS 15.0软件进行统计学处理。 各组细胞ADM、PTX和GEM的IC50值以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 Western blotting法检测胶质瘤U251细胞中DNA-PKcs的表达U251/ADM细胞中DNA-PKcs表达水平明显高于U251细胞(P<0.01)；经siDNA-PKcs处理后，U251/ADM/siDNA-PKcs细胞DNA-PKcs表达水平明显低于U251/ADM细胞(P<0.01)。见图 1。
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| 图 1 不同胶质瘤U251细胞中DNA-PKcs表达电泳图 Figure 1 Expressions of DNA-PKcs in different glioma U251 cells |
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U251/ADM细胞ADM、PTX和GEM的IC50值明显高于U251细胞(P<0.05)；经siDNA-PKcs降低DNA-PKcs表达后，U251/ADM/siDNA-PKcs细胞ADM、PTX和GEM的IC50值明显低于U251/ADM细胞(P<0.05)。见表 1。提示DNA-PKcs的表达沉默能逆转ADM耐药的U251细胞株的耐药性。
| (n=3,x±s,η) | |||
| Group | IC50 | ||
| ADM | PTX | GEM | |
| U251 cells | 9.25±1.28* | 2.31±0.13* | 0.28±0.04* |
| U251/ADM cells | 137.71±11.34 | 24.73±1.25 | 11.35±0.72 |
| U251/ADM/siDNA-PKcs cells | 26.84±2.36* | 6.93±0.52* | 2.16±0.12* |
| *P<0.05 compared with U251/ADM cells group. | |||
blotting法检测胶质瘤U251细胞中MDR1的表达 U251/ADM细胞中MDR1表达水平明显高于U251细胞(P<0.01)；经siDNA-PKcs处理后，U251/ADM/siDNA-PKcs细胞中MDR1表达水平明显低于U251/ADM细胞(P<0.01)。见图 2。提示MDR1是DNA-PKcs的下游作用位点。
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| 图 2 不同胶质瘤U251细胞中MDR1表达电泳图 Figure 2 Electrophoregram of MDR1 expressions in different glioma U251 cells |
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U251/ADM细胞中pAkt/S473、pNF-κB/p65和MDR1均明显高于U251细胞(P<0.01)；经siDNA-PKcs降低后DNA-PKcs表达后，U251/ADM/siDNA-PKcs细胞pAKT/S473、pNF-κB/p65和MDR1表达水平均明显低于U251/ADM细胞(P<0.01)；而3组细胞中总Akt和pAkt/T308蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图 3。
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| 图 3 不同胶质瘤U251细胞中Akt-NF-κB信号通路中蛋白表达电泳图 Figure 3 Electrophoregram of protein expressions in Akt-NF-κB signaling pathway in different glioma U251 cells |
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化疗是恶性胶质瘤重要的辅助治疗手段，然而恶性胶质瘤频繁出现的MDR降低了化疗的疗效，已成为其化疗的主要挑战。DNA损伤修复能力的增强是胶质瘤化疗耐受增加的原因之一，DNA双链断裂是大部分化疗药物的作用位点，DNA-PKcs是DNA非同源末端连接修复的重要调节者，其表达上调明显降低化疗中肿瘤细胞凋亡水平[7]。Tavecchio等[8]研究发现：人慢性淋巴细胞性白血病细胞中抑制DNA-PK表达则能降低其药物耐受，并且以DNA-PK为靶点能增强白血病患者化疗效果，改善患者预后。在获得性的PTX耐药的人胶质瘤U373细胞株中，DNA-PKcs的表达水平提高了3倍，而DNA-PKcs抑制剂NU7026逆转该化疗抗性[9]。上述研究提示DNA-PKcs与肿瘤MDR有密切关联，本研究拟探讨DNA-PKcs与脑胶质瘤化疗敏感性的相关关系及其分子机制。
多种MDR肿瘤细胞中均表现出DNA损伤修复能力提高，并呈现DNA-PKcs表达明显上调，两者呈正相关关系 [10]。本研究结果显示：U251/ADM细胞中DNA-PKcs表达水平明显高于正常U251细胞，这在恶性胶质瘤组织中也有发现，Yoon等[11]采用免疫组织化学法研究发现复发胶质瘤中DNA-PKcs阳性表达率高达73.68%。并且本研究中DNA-PKcs的基因沉默能明显降低ADM、PTX和GEM对ADM耐药的U251细胞株的IC50值，这提示DNA-PKcs能逆转U251/ADM细胞的耐药性。
临床研究[12]表明：复发胶质瘤中MDR关联蛋白的过表达是化疗失败的主要原因，而且培养的胶质瘤细胞和人高分化的胶质瘤细胞均有该类蛋白表达。MDR1定位于人7号染色质q21.1，其蛋白相对分子质量为1.70×105，能够结合并转运药物，在肿瘤化疗时表达增加，被认为是多药耐药形成主要原因[13]。本研究结果显示：MDR1在ADM耐药的U251细胞中呈高表达，并与DNA-PKcs表达上调有关。虽然MDR1是肿瘤治疗优秀的靶点，但临床上至今尚未开发出以MDR1为靶点的成功治疗手段，DNA-PKcs作为MDR1可能的上游作用位点，有潜力成为胶质瘤化疗增敏的重要靶点。
近年来研究表明：Akt-NF-κB信号通路与肿瘤MDR现象密切相关。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,Akt)是多个信号通路的枢纽蛋白，Akt可以通过其第307位苏氨酸位点(T307) 或第473位的丝氨酸位点(Ser473) 的磷酸化进入活化状态；核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是人体内重要的核转录调控因子，正常条件下NF-κB与其抑制分子结合存在于细胞质中，活化的Akt可通过磷酸化激活NF-κB而移位进入细胞核中，发挥核转录调控因子作用 [14]。已有研究[15-16]在肝癌细胞中发现：NF-κB能与MDR1基因启动子区域结合，激发MDR1蛋白的过量表达。本研究结果显示：ADM耐药的U251细胞中pAKT/S473、pNF-κB/p65上调，而DNA-PKcs的基因沉默能逆转该变化。上述结果提示DNA-PKcs的下游作用位点为Akt的Ser473，pAKT/S473能进一步磷酸化激活NF-κB，最终导致MDR1蛋白的过表达和胶质瘤U251细胞MDR。
综上所述，DNA-PKcs在U251/ADM细胞中呈高表达，下调DNA-PKcs表达能增强ADM耐药的U251细胞的化疗敏感性，其作用机制与激活Akt-NF-κB信号通路，诱导MDR1蛋白表达有关。DNA-Pkcs有潜力开发为胶质瘤化疗增敏的新靶点。
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