重症肌无力(myastheniagravis,MG)是指主要由乙酰胆碱受体(acetycholine receptor,AchR)抗体 (AchRAb)介导、细胞免疫依赖、补体参与、主要累及神经-肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)突触后膜AchR的获得性自身免疫性疾病^[1]。骨骼肌AchR在大部分情况下是自身免疫攻击靶点^[2]。该病治疗难度较大，容易反复发作，MG 的肌无力症状特点是眼外肌受累不对称，肢体无力基本对称，近端多重于远端，症状具有波动性，晨轻暮重，疲劳后加重，休息后好转^[3]。与其他自身免疫性疾病一样，MG目前尚无特效的治疗药物^[4]。临床常用胆碱酯酶抑制剂治疗，但大多疗效不持久，且不能影响疾病的进程^[3]。大量的临床研究^[5]表明：针灸治疗MG具有良好的疗效。基于“脾气虚久累及肾阳可至痿”的理论，在临床上采用“温阳补气”针刺和温灸相结合的方法治疗MG取得了良好的疗效。为了进一步揭示“温阳补气”针法治疗MG的效应机制，本研究将通过Real-time PCR法，对实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmunemyastheia gravis，EAMG)大鼠腓肠肌NMJ处 AchRmRNA表达水平进行检测和定量分析，为临床上MG的针灸治疗、临床诊断和疗效判定提供新的实验指标和依据。

SPF三级Lewis大鼠70只，雌性，7～8周龄，体质量150~160 g，毛色光滑润泽，足底红润，由北京维通利华提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001，检疫合格后，送到吉林大学白求恩医学院动物实验中心大鼠隔离环境动物饲养室，室温(20±2)℃，相对湿度60%~80%，饲养环境符合医学实验动物环境标准，由专门的饲养员饲养。合成的乙酰胆碱受体多肽片段(合成免疫原：Acetyleholine Receptorα1，Fragment 129-145，吉尔生化产品，规格：每支1.1mg，货号410717，Lot P141120-ZB，相对分子质量：2998.53，纯度：98.18％)；弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)(美国Sigma公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)和大鼠AchR-Ab ELISA 检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司)；溴吡斯的明(每片60mg，上海三维制药有限公司)；RNA抽提试剂盒(美国Invitrogen公司)；cDNA 合成试剂盒、PCR试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)；大鼠AchR及β-actin引物合成(北京鼎国生物技术公司)。Σ960型全自动酶标仪(美国Metertech公司)，SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，TGL-16B台式高速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)，FYL-YS-50L37℃恒温箱(北京福意电器有限公司)；电子天平(沈阳亮衡天平仪器有限公司)，凝胶电泳成像分析系统(美国BD公司)，紫外分光光度计(上海医疗仪器厂)，冷冻高速离心机(美国Fisher Scientific公司)，PCR仪(美国Thermo Electron公司)，涡旋电力匀浆器(上海医疗仪器厂)，水平电泳仪(北京六一仪器厂)，Bio-RadCFX96实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

将AchRα1 129-145多肽片段按照1/2的比例与CFA完全乳化，配比按照200μL溶液内含有50μg片段，不足部分用PBS定容，其步骤为先用PBS稀释多肽片段，无菌玻璃烧杯内放入CFA，将抗原溶液缓慢倒入其中，用200μL移液器反复抽吸混匀，直至变成乳白色黏稠的油包水乳剂。将乳化剂滴入冷水中，保持完整不分散、浮于水面时为合格的油包水剂。此过程在超净工作台中进行。

将大鼠按2 mL/200 g体质量经腹腔内注射4％水合氯醛麻醉，3 min后放在热板上，防止低温，消毒注射部位。将上述抗原乳剂以每只200μL注射于大鼠背部(6点，每点20μL)、两后足垫处(各20μL)、尾根部(40μL)。第2次免疫于首次免疫后第4周与首次免疫同法进行强化免疫。第3次免疫在首次免疫后第8周，将AChRα1 129-145多肽片段按照1/2的比例与IFA完全乳化，与首次免疫的同等量和同部位进行强化免疫接种，注射方式一律为皮下注射。大鼠EAMG模型成功判定标准^[9-10]：当Lennon症状分级评分≥1分、同时大鼠尾根血血清检测AchR-Ab阳性(P/N≥2.1)，则判定EAMG模型复制成功。

①实验动物分组：随机选取本次造模成功的30只EAMG大鼠分为模型对照组、针刺治疗组和药物对照组，另外将同批购进且相同条件下饲养的另外10只SPF级Lewis大鼠设为空白对照组。②干预方法：空白对照组，相同条件下饲养，每日抓取，不予其他干预；模型对照组，相同条件下饲养，每日抓取，不予其他干预；针灸治疗组，予以“温阳补气”针法治疗，具体操作如下：选取大鼠的手三里(前臂背侧外上四分之一分点处的肌肉间隙，左右各一)、足三里(膝关节下方、腓骨小头下5mm的肌肉间隙，左右各一)、脾俞(第十一胸椎后两旁的肋间隙，左右各一)和肾俞(第二腰椎后两凹陷，左右各一)；除手三里穴直刺5 mm外，其余3穴均直刺6 mm，针刺后行平补平泻手法，使针下沉紧，操作结束后在针上加高约1 cm的艾炷，连续灸3壮，并留针30 min，每日操作1次；药物对照组,给予溴吡斯的明灌胃治疗，根据《药理实验方法学》计算每只大鼠的溴吡斯的明给药量为18.5 mg·kg ^-1，用蒸馏水溶化溴吡斯的明，每日灌胃1次。以上各组大鼠的治疗以7d为1个疗程，疗程间休息1d，共2个疗程，观察15d。

取各组大鼠腓肠肌NMJ周围组织，称质量后，放入无RNA酶的EP管中，存入-80℃冰箱保存备用。

采用Trizol法常规提取总RNA，通过紫外分光光度计测定其吸光度(A)值，计算A(260)/A(280)的比值，检测RNA浓度，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测mRNA完整性，使用cDNA Synthesis Kit 进行逆转录反应合成cDNA。在GenBank中查找大鼠ε-AchR和γ-AchR基因的mRNA序列，采用Prime5.0软件设计引物，Oligo6.0软件进行比对分析。用ImageJ进行图像分析，以AchR条带A值/β-actin条带A值的比值作为不同组间mRNA的相对表达水平(R值)。每组样品分别做3次独立的 PCR 扩增和电泳，取3次检测的平均值。

采用SPSS17.0 软件进行统计学处理。各组大鼠AchR mRNA相对表达水平均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以 P<0.05 为差异有统计学意义。

与空白对照组比较，模型对照组、针刺治疗组和药物对照组大鼠腓肠肌NMJ处AchR mRNA相对表达水平明显降低(P＜0.01)；治疗后，与模型对照组比较，针灸治疗组和药物对照组大鼠AchR mRNA相对表达水平明显升高( P＜0.01)；与药物对照组比较,针刺治疗组大鼠AchR mRNA相对表达水平明显升高(P＜0.01)。见表 1。

PCR法检测各组大鼠腓肠肌NMJ处AchR mRNA相对表达水平 与空白对照组比较，模型对照组大鼠腓肠肌NMJ处AchR mRNA相对表达水平明显降低(P＜0.01)；与模型对照组比较，针刺治疗组和药物治疗组大鼠腓肠肌NMJ处AchR mRNA相对表达水平明显升高(P＜0.01)；与药物对照组比较,针刺治疗组大鼠腓肠肌NMJ处AchR mRNA相对表达水平明显升高(P＜0.01)。见表 2。

MG的发病是针对AchR的免疫应答异常而导致的传递障碍，其发病与AchR数量的减少和AchR功能的改变有密切关联，维持NMJ处AchR的数量和保护其功能的发挥，对MG疾病的治疗有着直接的影响。正常疲劳是肌肉连续释放出AchR数量递减，MG患者的肌无力或肌肉病态则是NMJ处AchR明显缺乏及抗体竞争作用而导致的^[11]。

正常生理情况下，NMJ处的AchR作为一种自身成分，遵循着形成、代谢和脱落的自然过程，经过胸腺选择性地消除针对AchR反应的淋巴细胞，使得机体产生免疫系统耐受。MG患者由于某种原因，使病毒感染胸腺上皮细胞，表面出现新的抗原决定簇,促使机体产生细胞和体液免疫应答反应。这种新的抗原决定簇与烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAchR)结构相似,从而导致nAchR数量减少^[12]。而nAchR是获得性MG主要的靶抗原^[13]。

nAchR是由4类5个亚基(α2βγδ或α2βεδ)组成的五聚体蛋白，γ(ε)亚基介于2个α-亚基之间，5个多肽链亚基排列成五边形对称结构。由于亚基组成的不同，nAchR可分为胚胎型(γ-AchR)和成熟型(ε-AchR)^[14]。ε-AchR于出生后随着神经末梢发育在运动终板区开始表达。Kaminski等^[15]研究发现：成年后，AchR主要表达为成熟型，仅在眼外肌上发现少量γ亚基的存在，而在肋间肌、腓肠肌等其他骨骼肌仅发现ε亚基的表达，γ-AchR是自身免疫系统攻击眼外肌的一种特异性靶分子。但国内有研究^[16]显示：在竖脊肌、腓肠肌和肋间肌同时发现了2种类型AchR的表达。有研究^[17]证明：在成熟肌纤维中， γ-AchR在突触外区域表达，而且ε-Ach Rm RNA 表达主要局限于运动终板突触膜下的胞核区域，AchR-Ab对γ-AchR介导的免疫应答不会引起NMJ传导阻滞。

祖国医学认为：MG的主要病因在脾、肾，是以脾气亏虚为始，久病伤及肾阳所致，脾失运化之司，使精微津液无以输布，迁延日久，病及肾阳，肾阳不足，难以温煦蒸腾，使肌肉骨骼不得津液精微荣养，日渐痿软无力。“温阳补气”针法依据“脾气虚久累及肾阳可至痿”的理论，遵循“治痿独取阳明”之古训，以手三里、足三里，实阳明之气血，以脾俞、肾俞，补先、后天之本，温补兼施，共奏温阳强筋，补气助力，壮肌治痿之功。

本研究结果显示：“温阳补气”针法可以有效改善EAMG大鼠的症状。“温阳补气”针法对γ-AchR 和ε-AchRmRNA表达均有影响，可从整体上增加nAchR mRNA的表达水平，对AchR mRNA表达有正向调节作用。但由于针刺治疗组大鼠γ-AchR mRNA和ε-AchR mRNA表达水平较模型对照组均有增加，因而不能证明“温阳补气”针法对其亚基转换间的影响。此外，针灸治疗组与药物对照组大鼠AchR mRNA表达水平比较差异有统计学意义，表明“温阳补气”针法对EAMG大鼠AchR mRNA表达的影响优于溴吡斯的明。

虽然针灸治疗本病的作用机制并未完全清晰，但由于针灸治疗本病效果明显，且无不良反应，可减轻患者痛苦和负担，值得在临床上推广。本课题组从EAMG大鼠NMJ处AchR mRNA表达水平的角度，分析了“温阳补气”针法治疗EAMG的部分作用机制。本研究结果表明：“温阳补气”针法可通过改善AchR mRNA表达水平，有效治疗EAMG。