双特异性蛋白激酶Wee1家族通过磷酸化失活细胞周期蛋白依赖激酶进而负调控细胞周期进程^[1-2]。目前，研究者已经从哺乳动物中相继鉴定出进化上高度保守的3种Wee1基因产物，即Wee1A、Wee1B和Pkmyt1^[3-6]。自从2000年Nakanishi等 ^[7]报道第一个人母源性Wee1B基因以来，最近才相继在不同物种中证实了Wee1B在小鼠、猪和恒河猴卵母细胞中的存在^[8-11]。本课题组^[12-14]前期研究发现：Wee1B蛋白在小鼠 1-细胞期受精卵的各个细胞周期动态表达，可能参与小鼠受精卵细胞的有丝分裂过程；干预Wee1B发现，Wee1B在小鼠受精卵G₂/M期转换过程中起阻滞作用。目前对蛋白激酶Wee1B的功能和调节的研究甚少，仅有几个已知的蛋白激酶如Cdc2/CyclinB、PKA等可以将其磷酸化^[15]，这些磷酸化反应发生后可改变Wee1B的蛋白激酶活性以及Wee1B与下游因子的作用方式。Wee1B在小鼠受精卵早期发育中活性如何受到调控进而影响细胞周期的进程目前尚不清楚。为了进一步阐明Wee1B在小鼠受精卵早期发育过程中调控的分子机制，本实验室以Wee1B为诱饵利用酵母双杂交系统从人卵巢 cDNA文库筛选出与蛋白激酶Wee1B相互作用的分子，进一步通过生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用中否能调控小鼠受精卵早期发育。因此，本研究拟通过探讨小鼠受精卵早期发育中Wee1B蛋白的生物学作用和调节方式，阐明Wee1B蛋白调控哺乳动物受精卵早期发育的分子机制，为肿瘤增殖和转移等临床研究开辟新的思路。

质粒pGBKT7由锦州医科大学栾治东博士惠赠，质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT由Marco Conti教授(University of California，San Francisco)惠赠。RNA PCR(AMV)Ver3.0试剂盒、SMARTScribe 逆转录酶、感受态DH5α、SalⅠ和SmaⅠ(日本TaKaRa公司)，人卵巢cDNA文库、酵母质粒提取试剂盒、酵母基质套装和酵母转化试剂盒(日本Clontech公司)，c-myc标签抗体(美国Santa Cruz公司)，HRP标记的山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Western细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂盒(北京碧云天生物技术公司)。水浴式电转印槽DYY-Ⅲ 40B型(北京六一仪器厂)，凝胶自动成像仪GDS8000、电泳仪和电泳槽(美国Bio-Rad公司)，紫外分光光度仪(美国PYE-UNICAM SPECTRONIC公司)。

以小鼠Wee1B编码基因的pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT质粒为模板，根据小鼠Wee1B (GenBank ID：NM_201370.2)序列，设计并合成引物，上游引物加SalⅠ酶切位点，下游引物加SmaⅠ酶切位点和终止密码子。引物由北京鼎国公司合成，上游引物5′-GGCGGCCCGGGGGCCGACACAGAGACTGACCAG-3′(下划线处为SalⅠ酶切位点)，下游引物5′-GCGTCGACCTACACGGA GGATGTCCCACGGG-3′(下划线处为SamⅠ酶切位点)。PCR反应体系为50 μL，PCR反应条件：94℃、7 min；94℃、45 s，55℃、1 min，72℃、3 min，35 个循环；72℃、10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，按照试剂盒说明书进行胶的回收和纯化。

Wee1B的构建和鉴定 PCR纯化产物和pGBKT7质粒载体分别用SalⅠ酶切反应，37℃孵育3 h后，将酶切产物进行纯化后再用SmaⅠ酶切，30℃孵育3 h，纯化后用T4连接酶与载体pGBKT7进行连接反应。反应体系为20 μL，16℃过夜。将2 μL连接产物转化到感受态细胞DH5α中，冰浴30 min，42℃水浴2 min，冰中骤冷2 min，加入970 μL LB培养基，在37℃条件下180 r·min^-1震荡培养1 h。取200 μL菌液涂布含有卡那霉素的琼脂平板，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆，摇菌(LB)过夜。用质粒提取试剂盒提取质粒后用SalⅠ和SmaⅠ酶切鉴定，选择酶切片段大小与预期相符合的阳性克隆，送至北京鼎国公司进行测序后经过BLAST比对验证。

Y2H golden菌液加入500 μL YPDA培养基中，混匀后涂于YPDA琼脂板，30℃倒置孵育3~5 d，接种环挑取2个大的酵母菌落接种于1 mL YPDA培养基中，制备酵母感受态细胞。取0.1 μg诱饵质粒DNA加入100 μL感受态细胞，42℃热激15 min，冰浴2 min，室温13 000 g 离心5 s，弃上清，加入1×TE buffer500 μL，重悬细胞；取重悬液100 μL铺板：设置阳性对照、阴性对照、工作板、检测毒性及自激活能力的培养板，分别将菌液接种于SD/Trp(SDO)、SD/Trp/X α Gal(SDO/X)和SD/Trp/X α Gal/AbA plates(SDO/X/A)培养板上；30℃倒置培养至克隆出现。

挑取新鲜酵母克隆于5 mL SDO液体培养基中，30℃、250 r·min^-1，培养16 h；将培养物扩大培养，30℃、250 r·min^-1，培养至吸光度[A(600)值]达到0.4~0.6；1 000 g 离心5 min，弃上清，沉淀置于－80℃冰箱中待用。细胞裂解液预热至60℃，迅速融化沉淀至预热裂解液中，70℃加热10 min，剧烈震荡1 min，13 000g、4℃离心5 min，转移上清至1.5 mL EP管，100℃水浴短暂煮样5 min，将以上提取的蛋白进行Western blotting检测。12% SDS-PAGE电泳分离后将蛋白转至PVDF膜上，1% BSA的TBST(pH 7.4)室温孵育PVDF膜2 h，封闭后的滤膜再与c-myc抗体(稀释比为1∶1 000)4℃反应过夜。经TBST洗涤后，HRP偶联的山羊抗鼠IgG作为二抗(1∶3 000)室温温育2 h，洗膜后，ECL发光液进行发光成像，观察目的条带是否出现。

于SDO板上挑取单克隆接种1 mL SDO培养基中，涡旋细胞；接种于50 mL SDO培养基中；30℃、260 r·min^-1培养至A(600)=0.8；1 000 g室温离心5 min；4 mL SDO培养基重悬细胞沉淀(细胞计数应达到1×10⁸)；室温水浴溶解1 mL library strain(人卵巢cDNA文库)，加到4 mL Bait Strain中，加入到2 L锥形瓶中；加入45 mL 2×YPDA (50 mg·L^-1 kana)；30℃、40 r·min^-1，慢摇20~24 h；20 h后稀释10倍滴于载玻片上，40倍镜下见所需相融合细胞；1 000 g室温离心10 min；25 mL 0.5×YPDA(50 mg·L^-1 kana)洗瓶2次，共50 mL，涡旋细胞。1 000 g室温离心10 min，弃上清；10 mL 0.5×YPDA(50 mg·L^-1 kana)涡旋细胞；稀释成4个浓度梯度1×10^-4、1×10^-3、1×10^-2和1×10^-1，各浓度吸取100 μL铺板于SDO、SD/leu和SD/leu/Trp；余下细胞铺15 mm DDO/X/A板，每板240 μL；30℃倒置培养3~5 d。3~5 d后通过计数DDO盘上的克隆数计算筛选出的克隆数；用牙签挑取DDO/X/A 盘上的所有蓝色克隆接种到QDO/X/A盘上；30℃倒置培养3~5 d，直至蓝色克隆出现。

从QDO/X/A盘上挑取蓝色克隆接种到3 mL SDO液体培养基中，涡旋细胞；培养收集酵母沉淀，按照酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，然后利用酵母pGADT载体的3′AD为引物进行PCR鉴定。反应产物经1% 琼脂糖凝胶电泳后成像。酵母质粒转化大肠杆菌，提取质粒送北京鼎国公司测序鉴定。在NCBI数据库进行BLAST分析，找到同源序列，统计序列长度、基因登录号、基因注释、读码框完整性和读码框一致性等信息。将测序后的质粒DNA与pGBKT7-Wee1B共同转化Y2H酵母感受态细胞，同时转化阳性对照(pGBKT7 53和pGADT7 T)和阴性对照(pGBKT7 Lam和pGADT7 T)的质粒。将转化后的酵母菌液均匀涂于SD/leu/Trp板上，30℃倒置培养3~5 d；挑取阳性克隆接种于SD/ leu/ Trp液体培养基中，30℃、250 r·min^-1过夜；将过夜培养物用棉签按浓度梯度涂QDO/X/A板，30℃倒置培养3~5 d。

以小鼠Wee1B编码基因的pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT野生型质粒为模板，设计特异Wee1B引物，通过PCR扩增出目的条带，目的基因为1 668 bp(图 1)。将胶回收后的目的基因与pGBKT7载体连接，构建pGBKT7 Wee1B质粒。酶切鉴定重组体pGBKT7 Wee1B，得到了与PCR扩增产物大小一致的片段(图 2)。pGBKT7 Wee1B经测序后，通过BLAST比对与NCBI数据库一致。

图 1　Wee1B基因PCR扩增结果 Figure 1　Amplification results of PCR of Wee1B gene

图选项

图 2　重组质粒pGBKT7 Wee1B酶切鉴定 Figure 2　Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pGBKT7 Wee1B

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复苏酵母菌，制备酵母感受态细胞，将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转入酵母感受态细胞中，将菌液分别接种于SDO、SDO/X和SDO/X/A培养基培养，用于检测自激活能力。SDO上为白色克隆，SDO/X上为白色或浅蓝色克隆，SDO/X/A上无克隆，表明诱饵质粒pGBKT7 Wee1B无自激活能力(图 3，见插页一)。将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转入酵母感受态细胞中，菌液接种于SDO板；将pGBKT7空载体转化酵母细胞，同样接种于SDO板培养，检测诱饵质粒对酵母细胞的毒性结果：2个SDO板上克隆都均匀生长(图 4，见插页一)。

从工作板SDO以及阳性对照板上挑取阳性克隆，摇菌扩大培养，收集酵母菌，裂解细胞提取蛋白，加热变性后，用c-myc抗体行Western blotting法验证结果：pGBKT7 Wee1B对应位置出现条带。见图 5。

图 5　酵母中诱饵质粒pGBKT7 Wee1B蛋白表达 Figure 5　Protein expression of bait plasmid pGBKT7 Wee1B in yeast

图选项

从工作板上挑取克隆扩大培养，将含有诱饵质粒pGBKT7 Wee1B的酵母菌与人卵巢cDNA文库相融合后进行筛选，再从QDO/X/A板上挑取蓝色克隆，裂解酵母菌，提取质粒，利用酵母 pGADT 载体的3′AD 为引物进行 PCR 鉴定(图 6)，由于cDNA文库中的片段具有多样性，所以基因条带大小不一。挑取53个克隆鉴定结果：其中的32个克隆中有插入片段。

图 6　PCR鉴定阳性克隆质粒 Figure 6　Identification of positive clones by PCR

图选项

将确定有插入片段的酵母中提取的质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取克隆，摇菌，提取质粒，经北京鼎国公司测序，通过BLAST比对，最终确定筛选出9个与蛋白激酶Wee1B存在相互作用的蛋白。

将最终筛选出的9个基因重新转化酵母感受态细胞，同时转化阳性对照(pGBKT7 53及pGADT7 T)和阴性对照(pGBKT7 Lam和pGADT7 T)的质粒，在QDO的板上验证筛选蛋白的自激活能力。图 7(插页一)为其中的一个基因酵母重新转化后验证的平皿，其他平皿与此一致。阳性对照按浓度梯度长出蓝色克隆，阴性对照无克隆，共转化pGBKT7 Wee1B和pGADT7 X的长出蓝色克隆，转化pGBKT7空载和pGADT7 X的无克隆。

酵母双杂交系统现已被广泛应用于筛选相互作用的蛋白^[17-18]。为了研究与Wee1B蛋白激酶有相互作用的蛋白，本研究首先针对小鼠Wee1B基因序列设计特异性引物，再以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT野生型质粒为模板，将Wee1B克隆到pGBKT7载体上。再将重组体pGBKT7 Wee1B转化Y2H酵母感受态细胞，通过观察其在不同培养板上的生长情况证实诱饵质粒pGBKT7 Wee1B对酵母细胞没有毒性，也没有自身激活能力，说明可以应用该诱饵质粒通过酵母双杂交系统来筛选与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白。

本研究利用酵母双杂交系统将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B与人卵巢cDNA文库相融合，通过不同程度营养缺陷的培养基筛选出与蛋白激酶Wee1B存在相互作用的蛋白，PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段，将确定有插入片段的酵母中提取的质粒转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，测序后BLAST比对，最终确定筛选出了9个与蛋白激酶Wee1B存在相互作用的蛋白。最后将该9个基因重新转化酵母感受态细胞，同时转化阳性对照和阴性对照的质粒，在QDO板上验证筛选蛋白的自激活能力。酵母双杂交结果假阳性高，本研究经过严格的逐步筛选降低克隆假阳性。经过生物信息学分析，9个可能与Wee1B存在相互作用的蛋白与卵母细胞和小鼠受精卵的生长发育密切相关，本课题组下一步将通过免疫共沉淀、GST pull down和共定位的方法在体内外证明筛选蛋白与Wee1B蛋白存在相互作用，并确定与Wee1B的作用方式，研究蛋白相互作用对小鼠受精卵早期发育的可能作用机制，为人类辅助生殖提供理论依据和实验基础。