膀胱癌发病率居中国男性泌尿生殖系恶性肿瘤的第1位，中国恶性肿瘤发病率第8位，占中国恶性肿瘤发病构成的2.5%^[1]，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。多发、容易复发、浸润和转移等是膀胱癌的特点，但目前尚无有效的膀胱肿瘤标记物，其发生机制尚未明确，晚期膀胱癌患者亦常因出现顺铂耐受而致化疗失败^[2]，故对膀胱癌的早期诊断及有效治疗仍是难题。硫化氢(hydrogen sulfide,H₂S)广泛存在于人体内并参与多种病理生理过程^[3-5]，被认为是人体内一种新的气体信号分子^[6]。亦有研究^[7]显示：H₂S及其合成酶参与肿瘤的病理生理过程，但其在膀胱癌中的表达及作用研究鲜有报道。本研究测定膀胱癌细胞株和膀胱正常上皮细胞株中H₂S及其合成酶胱硫醚β合成酶(cystathionine beta synthase,CBS)和胱硫醚γ裂解酶(cystathionine gamma lyase,CSE)的表达水平，同时采用外源性H₂S供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)处理膀胱癌EJ细胞株，旨在初步探讨H₂S及其合成酶在膀胱癌中的表达及作用。

胎牛血清(Gibco公司，澳大利亚)，RPMI-1640培养液(Thermo公司，美国)，CBS抗体(Abnova公司，美国)，CSE抗体(Santa Cruz公司，美国)，全蛋白提取试剂盒和MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(南京凯基生物)。HERA cell-150 CO₂细胞培养箱和Multiskan GO全波长酶标仪 (Thermo公司，美国)，PXS-270型离子计(上海雷磁仪器厂)，DYY-6C型双稳定时电泳仪(北京六一仪器厂)。

膀胱癌细胞株(5637、T24、EJ和UM-UC-3)及人膀胱上皮永生化细胞株SV-HUC-1由清华大学第一附属医院泌尿医学中心提供,培养在10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5% CO₂培养箱内。根据前期实验结果选取EJ细胞进行药物处理并分组如下：① 10 μmol·L^-1 NaHS组、50 μmol·L^-1 NaHS组、100 μmol·L^-1 NaHS组和对照组；②参照参考文献^[8]设顺铂组(5 μg·L^-1)和顺铂(5 μg·L^-1)+ NaHS(100 μmol·L^-1)组，另设无药物处理为对照组。

按全蛋白提取试剂盒说明书操作提取细胞总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度。各泳道蛋白上样总量为50 μg，加入5×样品缓冲液，95℃水浴变性5 min。样品蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗4℃孵育过夜，清洗膜3次(每次5 min)后，加二抗室温孵育1 h，弃二抗，振荡清洗3次，ECL显影。凝胶图像分析系统检测条带灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/GADPH条带灰度值。

参考耿彬等^[9]实验方法，制备10%细胞匀浆。取500 μL匀浆液，Bradford法蛋白定量后移至25 mL反应瓶，加入反应液(100 mmol·L^-1磷酸缓冲液，pH 7.4；10 mmol·L^-1左旋半胱氨酸；2 mmol·L^-1磷酸吡多醛)，反应瓶内小烧杯中加入NaOH(1 mol·L^-1)0.5 mL，用氮气将锥形瓶充盈20 s后，石蜡膜封口。将反应瓶置于37℃水浴中孵育90 min，加入50%三氯乙酸500 μL，37℃再孵育60 min后终止反应。取中央孔液体用敏感硫电极法测定溶液中H₂S水平，并计算H₂S产率。H₂S产率=H₂S水平/匀浆蛋白水平/反应时间，结果以nmol·mg^-1·min^-1表示。

按MTT试剂盒说明书操作。在96孔板上每孔中加入细胞100 μL(约1×10⁴个细胞)培养24 h。按实验分组处理。药物处理后，96孔板置于培养箱继续培养48 h。每孔加50μL 1×MTT，37℃孵育4 h，平板摇床摇匀，使MTT还原为甲臜，酶标仪在550 nm波长处检测每孔的吸光度(A)值，以A值表示细胞增殖活性。

Ⅴ-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡率 取对数生长期的EJ细胞，将1 mL细胞悬液(细胞数 4×10⁵ mL^-1)接种于6孔板，37℃、5% CO₂培养箱中培养48 h。按实验分组处理细胞后继续培养48 h。胰酶消化细胞收集于离心管，PBS 洗涤1次，离心，弃上清液，将细胞悬浮于100 μL PBS中，每管加 Annexin Ⅴ- FITC 5 μL，PI 2.5 μL，震荡混匀后置冰上避光染色10 min，每管加400 μL 1×Buffer，经流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果判定方法：左上象限数值为坏死细胞(FITC^－/ PI⁺)，左下象限数值为活细胞(FITC^－/PI^－)，右上象限数值为晚期凋亡或凋亡继发坏死细胞(FITC⁺/ PI⁺)，右下象限数值为早期凋亡细胞(FITC⁺/ PI^－)。

采用SPSS 18.0 统计软件对数据进行分析处理。各组细胞株中CBS和CSE蛋白表达水平、H₂S产率、细胞生存率和细胞凋亡率等数据均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

膀胱癌细胞株(5637、T24、EJ和UM-UC-3)中CBS和CSE蛋白表达水平高于人膀胱永生化上皮细胞SV-HUC-1，且差异均有统计学意义(P<0.05)，其中EJ细胞株中CBS和CSE表达水平较SV-HUC-1细胞株升高更为明显(P<0.01)。见图 1。

图 1　Western blotting法检测膀胱细胞株中CBS和CSE蛋白表达电泳图 Figure 1　Electrophoregram of expressions of CBS and CSE protein in bladder cell lines detected by Western blotting assay

图选项

SV-HUC-1、5637、T24、EJ和UM-UC-3细胞中H₂S产率分别为(9.20±1.83)、(23.70±2.14)、(27.80±3.57)、(60.50±2.36)和(42.40±2.11) nmol·mg^-1·min^-1。与膀胱正常上皮细胞SV-HUC-1比较，5637、T24、EJ和UM-UC-3细胞中H₂S产率均明显升高(P<0.05)，并以EJ细胞株升高最明显(P<0.01)。

外源性NaHS可提高细胞增殖活性，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且随着NaHS剂量增加，细胞增殖活性呈上升趋势，各NaHS组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

与对照组比较，顺铂组和顺铂+NaHS组药物处理后，细胞增殖活性均明显下降。而与顺铂组比较，顺铂+NaHS组EJ细胞的细胞增殖活性明显升高(P<0.05)。见表 2。

与对照组比较，顺铂组和顺铂+NaHS组药物处理后，细胞凋亡率均升高。与顺铂组比较，顺铂+NaHS组EJ细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。见表 2和图 2。

图 2　流式细胞术检测不同药物处理48 h后各组细胞凋亡率 Figure 2　Apoptotic rates of cells in various groups after treated with different drugs detected by flow cytometry for 48 h

图选项

人体内H₂S由重要的一碳单位供体蛋氨酸经转硫途径变为半胱氨酸后，主要由CBS和CSE催化合成^[10]。H₂S合成酶分布具有组织特异性，神经系统内主要存在CBS表达 ^[11]；主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉、门静脉和心肌组织中有CSE表达而无CBS表达^[12]；回肠黏膜等则同时存在有CBS和CSE表达^[13]。本实验结果显示：在膀胱癌及膀胱正常上皮细胞株中，CBS和CSE均有表达，且在膀胱癌细胞中2种酶的表达水平明显高于膀胱正常上皮细胞，这为探讨H₂S及其合成酶与膀胱癌的关系提供了实验基础，H₂S及其合成酶的这种异常表达亦有可能成为膀胱癌诊断的新标志物。

调节细胞增殖与凋亡是内源性H₂S发挥作用的主要途径之一。在结肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞中，内源性H₂S主要发挥促细胞增殖的作用^[13],H₂S水平增加可促进肿瘤增殖和迁移^[14]，而降低细胞H₂S水平则明显促进肿瘤细胞的凋亡^[15]。Sen等^[16]研究发现：肿瘤坏死因子α可通过促使转录因子SP1与CSE基因增强子结合，提高CSE蛋白表达，从而增加H₂S合成；H₂S与NF-κB的P65亚单位发生巯基化反应，进一步促使NF-κB与共活化核糖体蛋白S3结合，上调下游抗凋亡基因的表达，进而起到抗凋亡的作用。本研究结果显示：膀胱癌细胞中的H₂S及其合成酶水平明显高于膀胱正常上皮细胞，而外源性供给H₂S后，随着剂量的增加和/或药物作用时间的延长，可明显上调膀胱癌EJ细胞的增殖活力，这与文献报道^[14-15]结果相符，说明H₂S及其合成酶具有促肿瘤细胞增殖的作用，进一步推测Sen等^[16]报道的途径可能是膀胱癌异常增殖逃避凋亡的途径之一。

耐药性是临床肿瘤化疗失败的主要因素之一，基于顺铂的化疗方案，如顺铂和吉西他滨(GC)、顺铂联合甲氨蝶呤、长春碱和多柔比星(MVAC)方案被认为是晚期膀胱癌标准的化疗方案^[17]，但膀胱癌晚期患者常因顺铂耐药而导致化疗失败，因此减少肿瘤细胞顺铂耐药对晚期膀胱癌治疗至关重要。本研究MTT法及流式细胞术实验结果显示：顺铂对膀胱癌EJ细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用，而外源性H₂S干预后，膀胱癌细胞抗顺铂凋亡的能力明显增强，细胞增殖活性亦增强，说明膀胱癌细胞能借助H₂S抵抗顺铂的细胞凋亡作用，进行恶性增殖。研究^[18]报道：CSE特异性抑制剂炔丙基甘氨酸(PPG)可提高顺铂在膀胱癌中的疗效，这与本研究结果相符。Bhattacharyya等^[19]研究结果显示：在卵巢癌细胞中降低CBS表达减少H₂S合成后，降低了还原型谷胱甘肽(GSH)水平或降低过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的酶活性，从而增加活性氧自由基的产生，而这可导致脱氧核糖核酸的损伤，同时可增强癌细胞对顺铂的敏感性。Ahn等^[20]认为：GSH的降低可增强顺铂对膀胱癌细胞株的细胞毒性作用，其表达水平和膀胱癌细胞系顺铂耐药及阿霉素耐药呈正相关关系。H₂S在体内代谢的终末产物正是还原性物质GSH，结合本研究结果，癌细胞可能通过上调H₂S及合成酶水平，以增加GSH水平，从而抵御顺铂的细胞毒性作用，这可能是膀胱癌顺铂耐药的机制之一。

综上所述，H₂S及其合成酶CBS和CSE在膀胱癌细胞系和膀胱正常上皮细胞系中均有表达，在膀胱癌细胞系中H₂S及其合成酶表达较膀胱正常上皮细胞明显增加，外源性H₂S可增强膀胱癌EJ细胞的增殖活力，可减弱顺铂介导的细胞凋亡。