PCR芯片技术是近年来研究药物抗菌机制的新型高通量研究技术，具有高灵敏性、高特异性和可重复性的特点^[1]，该方法在世界范围已经得到了广泛的认可及应用^[2]。慢性非萎缩性胃炎是指不伴有胃黏膜萎缩性改变、胃黏膜层出现以淋巴细胞和浆细胞为主的慢性炎症细胞浸润的慢性胃炎^[3]，因其症状不明显，易造成患者对该病不重视、不就诊，从而使其病程迁延不愈，极易复发，严重影响患者的生活质量^{[4, 5, 6]}。研究 ^{[7, 8]} 显示：胃炎与胃癌的发生存在密切联系，特别是幽门螺杆菌诱发的胃炎发展为胃癌的概率更大。本课题组前期研究^[9]显示：清胃止痛微丸联合标准三联疗法对幽门螺杆菌诱发的慢性非萎缩性胃炎伴糜烂者临床疗效确切，并能快速缓解上腹疼痛症状；且体外研究^[10]显示:清胃止痛微丸对幽门螺旋杆菌具有一定程度的抑制作用。为进一步解释此组合疗法治疗幽门螺杆菌诱发的慢性非萎缩性胃炎的分子机制，本课题在临床研究和体外药效学研究基础上，筛选慢性非萎缩性胃炎并发幽门螺杆菌感染患者为研究对象，采用PCR芯片技术对患者治疗前后的基因进行测定，分析清胃止痛微丸组合疗法治疗慢性非萎缩性胃炎过程中患者基因的变化情况，阐明清胃止痛微丸组合疗法治疗幽门螺杆菌诱导的慢性非萎缩性胃炎的分子机制，以期为该病的临床治疗和药物推广提供理论依据。

埃索美拉唑(商品名为耐信，无锡阿斯利康制药有限公司，批号：1267058，批准文号：国药准字H20046379)，克拉霉素(哈尔滨哈药集团制药六厂，批号：120801，批准文号：国药准字H19980088)，替硝唑(山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司，批号：120105，批准文号：国药准字H20033090)，清胃止痛微丸(吉林华康药业股份有限公司，批号：120201，批准文号：国药准字Z20050089)，Trizol(美国Invitrogen公司，批号：14105)，氯仿(批号：20120323)、异丙醇(批号：20111202)和无水乙醇(批号：20110912)(北京化工厂)，DEPC(美国Genview公司，批号：39F001100)。低温离心机(Heraeus Fresco 21 centrifuge，美国Heraeus公司)，PCR仪(AB7300 Real-Time PCR System，美国AB公司)，紫外分光光度计(美国BioTek Epoch公司)。

治疗组：选取2011年11月—2013年1月于吉林大学第一医院胃肠内科通过胃镜检查诊断为慢性非萎缩性胃炎并且幽门螺杆菌感染为阳性的患者10例，年龄18～65岁，男女各5例，分别抽取治疗组患者治疗前后抗凝外周血。随机选取健康者10人作为健康对照组，年龄18～65岁，男女各5人，抽取抗凝外周血。

治疗组患者口服埃索美拉唑20 mg、克拉霉素500 mg和替硝唑500 mg，均每日2次；清胃止痛微丸3.2 g，每日3次口服 ，共7 d；然后继续口服埃索美拉唑和清胃止痛微丸7 d，剂量同前。

取各组研究对象抗凝外周血0.5 mL置于无RNA酶离心管中，加3倍体积Trizol，震荡混匀，室温静置5 min；4℃、12000 g离心15 min。用移液器吸取上清，至无RNA酶离心管，按照Trizol∶氯仿=5∶1的比例加入氯仿，涡旋15 s，静置3 min；4℃、12000 g离心15 min。取上清置于无RNA酶离心管中，按Trizol∶异丙醇=5∶1的比例加入预冷的异丙醇。混匀、室温静置10 min，4℃、12000 g离心15 min。小心吸弃上清，留管底沉淀，加入1 mL由DEPC水配置的75%乙醇，吹打混匀，4℃、8000 g离心5min。弃上清，倒置于干净的滤纸片刻，开盖，挥发乙醇2～3min，加入15 μL DEPC水，吹打混匀。

按照QIAGEN QuantiTect Rev. Transcription Kit试剂盒 (批号：151020450) 的操作方法将RNA逆转录为cDNA，紫外分光光度计测定cDNA浓度。

按照RT2 Profiler PCR Array Human Antibacterial Response(批号：7391100304)的操作方法进行操作，检测基因见表1。采用SABiosciences对PCR Array数据进行分析。 采用2^-△△Ct法计算基因的相对表达水平。

采用SPSS18.0统计软件进行统计学处理。各组NLRP3炎性复合体相关基因表达水平以平均数表示，组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

人类抗菌应答PCR芯片测定84个基因中，与健康对照组比较，治疗组慢性非萎缩性胃炎患者治疗前20个基因表达水平明显上调(Fold-change＞2)，治疗后上调的20个基因表达水平明显下调，其中11个基因表达水平接近健康对照组，9个基因表达水平仍高于健康对照组。见图1和2。

图1 治疗前治疗组和健康对照组研究对象基因表达水平散点图 Fig.1 Scatter plots of gene expressionlevels of subjects in treatment group and health control group before treatment

图选项

图2 治疗后治疗组和健康对照组研究对象基因表达水平散点图 Fig.2 Scatter plots of gene expressionlevels of subjects in treatment group and health control group after treatment

图选项

与健康对照组比较，治疗组慢性非萎缩性胃炎患者治疗前NLRP3炎性复合体相关基因CASP1、IL1B、NLRP3和PYCARD的表达水平明显上调(P＜0.05)；与治疗前比较，治疗后CASP1、IL1B、NLRP3和PYCARD基因表达水平明显下调(P＜0.05)。见表2。

PCR 芯片技术是分析信号通路或某种生物学功能相关基因表达状态的首选工具，该技术克服了常规杂交芯片假阳性率高及大量数据难于有效分析的缺陷。本实验选用的人类抗菌应答PCR芯片含有84个固有免疫相关的抗菌基因，包括3个PRR家族(TLRs、NLRs和RIG-Ⅰ)启动的固有免疫应答。TLRs、NLRs和其他PRRs识别细菌的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，包括脂多糖(LPS)、肽聚糖和鞭毛。PCR芯片含有细菌相关的PRR信号传导相关基因、编码下游炎症相关和凋亡相关的效应蛋白基因及编码免疫细胞表达的抗菌肽基因。本研究结果显示：幽门螺杆菌诱发的慢性非萎缩性胃炎患者外周血中20个基因表达水平明显上调(Fold-change＞2)，其中包括NLRP3炎性复合体相关基因，采用清胃止痛微丸联合三联疗法治疗后20个上调的基因表达水平明显下调。

NLRP3炎性体是目前发现配体数最多的炎性体，其配体包括多种细菌、病毒、真菌、寄生虫及其毒素和细胞内的危险信号^{[11, 12]}。当NLRP3炎性体被激活时，NLRP3蛋白、PYCARD蛋白和 pro-caspase-1蛋白迅速组装成炎性复合体，激活caspase-1。caspase-1作为炎性体的效应蛋白，将无活性pro-IL-1β前体剪切为成熟IL-1β，从而使IL-1家族细胞因子参与后续炎症因子分泌及炎症反应的发生^{[13, 14, 15]}。

综上所述，本研究结果表明：幽门螺杆菌诱发 的慢性非萎缩性胃炎患者外周血中NLRP3炎性复合体出现明显的激活现象，采用清胃止痛微丸联合三联疗法治疗后该炎性复合体激活受到抑制，这可能是清胃止痛微丸联合标准三联疗法治疗幽门螺杆菌诱发的慢性非萎缩性胃炎的分子机制。