乳腺癌的发病率已占女性癌症的首位，随着肿瘤分子生物学研究的逐步深入，信号转导通路的研究也越来越受到关注。目前研究^{[1, 2]}表明：转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号途径不但在细胞及生物体生长与发育过程中起重要作用，而且与人体肿瘤的发生发展密切相关。细胞信号转导分子Smad2和Smad4是TGF-β信号转导通路中的重要分子。当二者发生异常改变时，可导致信号通路紊乱而使细胞逃脱TGF-β1介导的生长抑制效应而发生肿瘤。有关TGFβ/Smads信号通路中Smad2和Smad4蛋白在乳腺癌发生中的作用机制尚不清楚。本研究应用免疫组织化学法检测Smad2和Smad4蛋白在乳腺癌组织中的表达，分析其表达与乳腺癌临床病理参数间关系，探讨Smad2和Smad4蛋白在乳腺癌发生发展中的分子机制。 吉林大学学报(医学版) 第42卷 第4期 2016年7月 刘楠楠，等. Smad2和Smad4蛋白在乳腺癌组织中的表达及其意义

选取2010—2014年北华大学附属医院病理科53例乳腺导管癌蜡块存档标本，其中50例有相对应的癌周正常乳腺组织。53例乳腺导管癌患者年龄35 ～73岁，平均年龄(50.21±7.43)岁，均为女性、原发、单侧乳腺导管癌，临床病例资料记录详细。

兔抗人Smad2单克隆抗体和Smad4单克隆抗体均购自英国Abcam公司，通用型免疫组织化学SP试剂盒及DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

恶性肿瘤国际临床病期(T和N分期)根据2010年美国癌症联合会分期指南(AJCC Cancer Staging Manual)^[3]标准确定，见表1。乳腺癌病理诊断参照2003年WHO乳腺病理学分类(WHO分类)中的形态学标准^[4]。

乳腺组织采用10%甲醛液固定，梯度酒精脱水，透明，浸蜡，包埋，连续切片，厚4μm，HE染色，光镜下观察，确定病理诊断。留取白片待做免疫组织化学染色，检测Smad2和Smad4蛋白表达情况。染色方法按常规操作步骤进行。以正常动物血清代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。

评估标准采用盲法阅片方式，随机选取5个高倍视野(×400)，以染色强度和阳性细胞率的得分之乘积进行评估。Smad2以细胞质出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞；Smad4以细胞质和(或)胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。染色结果按每张切片的阳性细胞数比例及着色深浅计分，行半定量分析。阳性细胞数百分率(A)评估：A<10%为0分，10%≤A≤25%为1分，25％<A≤50%为2分，50%<A≤75%为3分，A>75%为4分。染色强度(B)评估：无着色或背景均匀一致的浅黄色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据免疫反应积分(immunoreactive score,IRS)(IRS=A×B)进行最终计分评估，分值越高，蛋白表达水平越高。

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。Smad2和Smad4蛋白表达水平以±s表示，二者在乳腺癌组织与癌周正常组织中表达水平比较采用配对样本Wilcoxon符号秩和检验，Smad2与Smad4蛋白阳性表达率的相关性及其与临床病理参数间的关系采用Spearman等级相关分析。以p<0.05为差异有统计学意义。

Smad2蛋白主要呈弥漫性分布于细胞质，Smad2蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，其IRS明显高于癌周正常乳腺组织(Z=－2.08，p<0.05)。Smad4蛋白主要存在于细胞质与细胞核中，在乳腺癌组织中Smad4蛋白表达水平明显低于癌周正常乳腺组织，差异有统计学意义(Z=－5.01，P<0.01)。见表2及图1(插页四)。

表2 不同组织中Smad2和Smad4蛋白表达水平 Tab.2 Expression levels of Smad2 and Smad4 proteins in different tissues

(±s)
Group	n	IRS
		Smad2	Smad4
Surrounding normal tissue	53	4.29±2.57	7.27±0.77
Breast carcinoma tissue	53	5.89±3.05 *	5.37±1.59**
* p<0.05， * * P<0.01 compared with surrounding normal tissue group.

表选项

53例乳腺癌组织中有36例Smad2和Smad4蛋白同时呈阳性表达，有13例同时呈阴性表达，有4例为Smad4蛋白呈阴性表达而Smad2蛋白呈阳性表达，但无Smad4呈阳性表达而Smad2呈阴性表达者，Spearman等级相关分析表明：Smad2与Smad4阳性表达呈正相关关系(r= 0.830,P<0.01)。见表3。

Smad2和Smad4蛋白阳性表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结及远处转移及ER、PR表达无相关性(P>0.05)，但与HER2的阳性表达呈负相关关系(r=－0.388,P<0.01;r=－0.360,P<0.01)，与乳腺癌病理分级呈负相关关系(r=－0.331,p<0.05;r=－0.388,P<0.01)。见表4。

近年来研究^[5]表明：Smads蛋白是将TGF-β家族信号从受体传到胞核的转导分子。TGF-β首先与细胞表面受体(TβRⅡ和TβRⅠ)结合，受到受体活化的刺激，细胞质内Smad2、Smad3蛋白与TβRⅠ激酶瞬时结合，并被磷酸化和活化。磷酸化的Smad2、Smad3与Smad4形成异源复合物，转位到细胞核，与特异DNA序列结合调节基因的转录^[6]，通常认为Smad2和Smad4主要参与TGF-β1信号转录^[7]。

本研究结果显示：在乳腺癌组织中Smad4的表达明显低于癌周正常组织，并与乳腺癌病理级别呈负相关关系，即随乳腺癌级别增高Smad4阳性表达降低，提示Smad4蛋白表达的减少甚至丢失伴随并促进肿瘤的进展，在这部分乳腺癌中Smad4可能发挥抑癌基因的作用。该结果也与先前对乳腺癌穿刺标本和乳腺癌组织芯片标本的研究^{[8, 9]}结果一致，同时得到了其他研究的支持。研究^[10]显示：在乳腺导管癌中Smad4mRNA表达水平低于正常乳腺组织。通过对正常乳腺上皮细胞系MCF10A和恶性度不同的乳腺癌细胞系的比较^[11]发现：Smad4蛋白在良性MCF10A细胞、癌前病变上皮细胞MCF10At1k.cl2、浸润癌细胞MCF10CA1a中的表达呈递减状态；对这些肿瘤同时进行Smad2蛋白表达检测发现：与Smad4相似，Smad2蛋白表达与乳腺癌的病理学级别也呈负相关关系，即随乳腺癌病理学级别增高其阳性表达降低，并通过相关性检验证实Smad2与Smad4间存在正相关关系，进一步提示Smad2表达降低或丢失同样伴随乳腺癌的进展。尽管Smad2较少被看作抑癌基因，但一些研究^{[12, 13]}证实：Smad2的功能失活 足以抑制TGF-β的生理功能。研究者^[14]检测Smad2靶向敲除的鼠角质形成细胞发现：Smad2 ^－/－鼠不会自然发展成皮肤肿瘤，但在化学致癌实验中能加速肿瘤的形成和恶性转化，Smad2^－/－肿瘤分化更差，且显示出促进上皮细胞- 间充质转化(EMT)和血管发生的现象，表明Smad2丢失不是肿瘤的起始事件，但Smad2缺陷的上 皮组织更易形成肿瘤并发生恶性转化。在本研究中，Smad2和Smad4蛋白表达皆为阴性的乳腺癌患者13例，本文作者推测在这部分乳腺癌中，Smad2与Smad4同时失表达可能会起协同作用而促进乳腺癌进展，虽然尚不清楚原因，但有研究^[15]显示：Smad2 MH1与MH2区的错义突变和羧基端的截断可能会导致Smad4蛋白的不稳定和遍在蛋白连接酶SCF^SKP2催化的蛋白酶体途径的降解。Smad4和Smad2作为TGF-β途径中重要的信号传递分子，其同时表达降低或失表达可能会影响TGF-β对细胞生长抑制作用的调控，而使细胞恶性增殖。

本研究结果显示：Smad2和Smad4蛋白的阳性表达率与患者的年龄、肿瘤的大小、淋巴结转移情况、远处转移及乳腺癌检测指标ER和PR的表达无相关关系，这与有关的研究^[11]结果相似。

本研究结果显示：Smad2和Smad4蛋白的阳性表达均与HER2的阳性表达呈负相关关系，即随着Smad4和Smad2阳性表达率降低，HER2阳性表达率升高，意味着在低分化的乳腺癌中呈现出Smad2(－)/Smad4(－)/HER2(+)的表达特点。研究^[16]证实：HER2高表达乳腺癌一般分化较差，预后不良，这正与本研究结果吻合。目前Smad2/Smad4与HER2之间直接的相关调节未见报道，但在对TGF-β/Smads信号途径的研究^[17]中发现：TGF-β通过Smad传递信号，而Smad信号又受到Ras/Erk/MAPK的调节，HER2/Neu是MAPK途径重要的激活剂。在乳腺癌中HER2/Neu活性的升高将会通过Erk MAPK途径阻碍TGF-β通过磷酸化Smad蛋白而实现的生长抑制功能^[18]，这或许无法解释在HER高表达的肿瘤中Smad2和Smad4的表达降低或丢失，但可能对理解部分乳腺癌中Smad2(－)/Smad4(－)/HER2(+)的表达特点有重要意义。此外，鉴于HER2和Smads对细胞增殖正负调控作用的不同，本研究也观察到Smads蛋白阳性表达与HER2的阳性表达呈负相关关系，但详细的分子机制及共调解环路的信号途径还有待进一步研究。

综上所述，Smad2和Smad4蛋白至少在部分乳腺癌中发挥抑癌基因的作用，检测Smad2和Smad4蛋白表达既可作为评估乳腺癌进展、恶性程度及预后的重要生物学指标，又有利于了解乳腺癌发病的分子机制，本研究结果为临床诊断和治疗乳腺癌提供了新的途径。