吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (04): 742-745

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石立强, 陈丽娜, 李洪宇, 谢立亚, 糜心雅, 苑广信, 孙晶波, 王曼力, 徐广宇, 韩笑, 赵南晰, 盛瑜, 杜培革, 安丽萍
SHI Liqiang, CHEN Lina, LI Hongyu, XIE Liya, MI Xinya, YUAN Guangxin, SUN Jingbo, WANG Manli, XU Guangyu, HAN Xiao, ZHAO Nanxi, SHENG Yu, DU Peige, AN Liping
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 742-745
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(04): 742-745
10.13481/j.1671-587x.20160421

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收稿日期: 2016-01-04
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石立强, 陈丽娜, 李洪宇, 谢立亚, 糜心雅, 苑广信, 孙晶波, 王曼力, 徐广宇, 韩笑, 赵南晰, 盛瑜, 杜培革, 安丽萍. 高活性小牛血去蛋白提取物对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 742-745.
SHI Liqiang, CHEN Lina, LI Hongyu, XIE Liya, MI Xinya, YUAN Guangxin, SUN Jingbo, WANG Manli, XU Guangyu, HAN Xiao, ZHAO Nanxi, SHENG Yu, DU Peige, AN Liping. Protective effect of high activity deproteinized extract of calf blood on alcohol liver injury of mice[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(04): 742-745.
高活性小牛血去蛋白提取物对小鼠酒精性肝损伤的保护作用
石立强, 陈丽娜, 李洪宇, 谢立亚, 糜心雅, 苑广信, 孙晶波, 王曼力, 徐广宇, 韩笑, 赵南晰, 盛瑜, 杜培革 , 安丽萍     
北华大学药学院微生物与生化药学教研室, 吉林 吉林 132013
收稿日期: 2016-01-04;
基金项目: 吉林省科技厅科技创新与科技成果转化计划基金资助课题（0150312014ZX）；吉林省卫计委科研项目资助课题（2014078）；吉林省发改委科研基金资助课题（2014Y103）；吉林省科技厅医药产业发展基金资助课题（20140311084YY）
作者简介: 石立强(1991-),女,吉林省四平市人,在读医学硕士,主要从事药物分析方面的研究。
通信作者: 杜培革,教授,硕士研究生导师(Tel:0432-64608278,E-mail:dupeige2001@126.com)
安丽萍,副教授,硕士研究生导师(Tel:0432-64608278,E-mail:alp960@126.com)
摘要: 目的：观察小牛血去蛋白提取物（DECB）对乙醇所致小鼠肝损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制。方法：健康ICR小鼠60只，随机分为对照组、模型组、阳性药物组和低、中、高剂量DECB组，每组10只。腹腔灌胃给药，对照组小鼠给予生理盐水20 mL·kg -1，低、中和高剂量DECB组小鼠分别给予 0.125、0.250和0.500 g·kg-1DECB，阳性药物组小鼠给予护肝片0.63 g·kg -1，每天1次，连续30d，末次给药1 h 后，除对照组外，其他各组小鼠一次性给予50%乙醇14 mL·kg -1，并禁食16 h建立急性酒精性肝损伤模型。测定小鼠的耐受酒精时间和醉酒时间，检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，检测肝组织中甘油三酯（TG）、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平，并进行肝组织病理切片检查。结果：与模型组比较，各剂量DECB组小鼠醉酒症状明显减轻，高剂量DECB组和阳性药组小鼠酒精耐受时间延长（P <0.05），醉酒时间缩短（P <0.05），中、高剂量DECB组小鼠血清ALT和AST活性均明显降低（P <0.05）。与模型组比较，中、高剂量DECB组和阳性药物组小鼠肝组织中MDA和TG水平明显降低（P <0.05），GSH水平明显升高（P <0.05）。高剂量DECB组小鼠乙醇所致肝组织病理学损伤明显减轻。结论：DECB能明显改善乙醇所致肝损伤，其机制可能是通过抑制肝组织氧化应激反应实现的。
关键词: 高活性小牛血去蛋白提取物    酒精性肝损伤    氧化应激    
Protective effect of high activity deproteinized extract of calf blood on alcohol liver injury of mice
SHI Liqiang, CHEN Lina, LI Hongyu, XIE Liya, MI Xinya, YUAN Guangxin, SUN Jingbo, WANG Manli, XU Guangyu, HAN Xiao, ZHAO Nanxi, SHENG Yu, DU Peige , AN Liping     
Department of Microbiology and Biochemistry, School of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China
Abstract: Objective: To observe the protective effect of deproteinized extract of calf blood(DECB) on the ethanol-induced liver injury of the mice, and to preliminaryly discuss its mechanism. Methods: Sixty healthy ICR mice were divided into control group, model group, positive drug group,low,medium and high doses of DECB groups (n=10).By intragastric administration, the mice in control group were given 20 mL·kg-1saline solution, the mice in low, medium and high doses of DECB groups were administrated with 0.125,0.250,0.500 g·kg -1 DECB, and the mice in positive drug group were administrated with 0.63 g·kg -1Hugan Tablets;once a day for 30 d. 1 h after the last administration, except control group,the mice in other groups were administrated with one-time grant of 50% ethanol 14 mL·kg -1, and fasted for 16h to establish the models of acute alcohol liver injury. The endurance alcohol time and drunk time of the mice were determined,the activities of aspartate aminotransferase (ALT) and alanine transaminase (AST) activity in serum of the mice were detected, the levels of triglyceride (TG), glutathione (GSH) and malonic dialdehyde (MDA) in liver tissue were determined,and the pathological changes of liver tissue were detected. Results: Compared with model group, the drunk symptoms of the mice in different doses of DECB groups were obviously reduced, the endurance time of the mice in high dose of DECB group and positive drug group was prolonged (P <0.05), and the drinking time was shortened (P <0.05);the ALT and AST activities in serum in mediun and high doses of DECB groups were significantly lower than those in model group (P <0.05).Compared with model group, the MDA and TG levels in liver tissue of the mice in medium and high doses of DECB groups and positive drug group were obviously reduced, and the GSH levels were increased(P <0.05);compared with model group, the pathological damages of liver tissue of the mice in high dose of DECB group caused by ethanol were significantly reduced. Conclusion: DECB can improve ethanol-induced liver injury which may be related to the inhibition of hepatic oxidative stress response.
Key words: high activity deproteinized extract of calf blood    alcoholic liver injury    oxidative stress    

酒精性肝炎作为进行性疾病，往往导致肝硬化和肝癌，其重症患者短期死亡率很高[1, 2]。小牛血去蛋白提取物(deproteiniz edextract of calf blood,DECB)是一种从小牛血清中提取的小分子生物活性物质，其中30%的有机成分包括低分子多肽、核苷、氨基酸和寡糖等。目前临床上DECB主要用于治疗脑细胞代谢障碍性疾病，同时还具有角膜修复功能[3, 4]。本课题组一直致力于DECB相关研究，改进其生产工艺，提高药效学活性，这种DECB生产工艺已经获得国家授权专利(专利号：201210434370.7)[5]。有研究[6, 7]表明：DECB具有消除氧自由基、促进细胞修复等作用。但其对肝组织的保护作用鲜少报道。本研究以DECB作为解酒及保肝剂，在构建小鼠酒精性肝损伤模型基础上，观察其解酒及保肝作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法 1.1 动物、主要试剂和仪器

健康ICR小鼠60只，雄性，体质量( 20±2) g，由吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供(许可证号: 201500010623)。DECB由长春长庆药业有限公司提供，护肝片由黑龙江葵花药业股份有限公司提供(批号201408073)，谷胱甘肽(GSH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛( MDA) 和甘油三酯(TG)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号分别为20150611、20150508、20150607、20150426和20150523)。SPX-250B-Z型恒温生化培养箱(上海博远实业有限公司)，5430R低温高速离心机(美国Eppendorf公司)，Infinite M200型酶标仪(瑞士TECAN公司)。

1.2 动物分组和给药

健康ICR小鼠60 只适应性喂养3 d。随机分为对照组、模型组、阳性药物组和低、中、高剂量DECB组，每组10只。对照组小鼠给予生理盐水20 mL·kg -1，每天1 次，低、中和高剂量DECB组小鼠分别给予0.125、0.250和0.500 g·kg -1 DECB；阳性药物组小鼠给予护肝片0.63g·kg-1，模型组小鼠给予20 mL·kg -1生理盐水，连续灌胃给药30 d。

1.3 急性酒精性肝损伤模型制备

除对照组外，其余各组小鼠均在末次给药1h后，一次性给予50%乙醇14mL·kg -1，空白组小鼠给予等量的生理盐水灌胃。记录各组小鼠的耐受酒精时间(从灌酒到翻正反射消失)和醉酒时间(从翻正反射消失到翻正反射重新开始)。造模结束后，模型组死亡1只小鼠，低剂量DECB组死亡2只小鼠，其他各组无死亡情况。

1.4 小鼠血清生化指标检测

各组小鼠禁食16 h 后，取外周血，离心血清，按照试剂盒说明书方法测定ALT和AST活性。取小鼠肝脏，用冷生理盐水冲洗后制备10%肝匀浆，离心后取上清，参照试剂盒说明书方法测定TG、GSH及MDA水平。

1.5 小鼠肝组织HE染色

取小鼠肝脏，用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，光镜下观察小鼠肝组织病理学表现。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。小鼠酒精耐受时间和醉酒时间，血清ALT和AST活性，肝组织中TG、GSH和MDA水平均以±s表示，组间比较采用t检验。以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 各组小鼠酒精耐受时间和醉酒时间

与模型组比较，各剂量DECB组小鼠醉酒症状均明显减轻。 与模型组比较，高剂量DECB组和阳性药物组小鼠酒精耐受时间延长(P＜0.05),醉酒时间缩短(P＜0.05)。见表1。

表1 各组小鼠酒精耐受时间和醉酒时间 Tab.1 Endurance time and drunk time of mice in various groups
(±s,t/min)
GroupnEndurance time Drunk time
Control10－－
Model 911.10±3.13167.63±16.12
DECB
Low1016.43±8.21140.56±12.44
Medium 1018.33±10.45124.95±12.43
High 822.25±7.44 * 117.51±16.28 *
Positive drug1020.20±7.84 * 120.43±15.36 *
“-”:No data. * P＜0.05 vs model group.
表选项
2.2 各组小鼠血清ALT和AST活性

与对照组比较，模型组小鼠血清ALT和AST 活性均明显升高( P＜0.05)；与模型组比较，中、高剂量DECB组和阳性药物组小鼠血清ALT和AST 活性明显降低( P＜0.05)。见表2

表2 各组小鼠血清ALT和AST活性 Tab.2 Activities of serum ALT and AST of mice in various groups
[±s,λB／(IU·L-1)]
GroupnALTAST
Control1020.03±2.4136.02±7.71
Model 943.26±9.95 * 58.41±7.88 *
DECB
Low 1037.86±7.5349.25±6.25
Medium 1027.27±8.62 △ 43.46±7.23 △
High 826.95±4.47 △ 40.21±4.44 △
Positive drug1025.72±8.22 △ 40.66±9.58 △
* P＜0.05 vs control group； △ P＜0.05 vs model group.
表选项
2.3 各组小鼠肝组织GSH、MDA和TG水平

与对照组比较，模型组小鼠肝组织GSH水平明显降低( P＜0.05)，MDA 和TG水平明显升高(P＜0.05)。与模型组比较，中、高剂量DECB组和阳性药物组小鼠肝组织GSH水平明显升高(P＜0.05) ， 各剂量DECB组小鼠肝组织MDA和TG 水平明显降低(P＜0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肝组织中GSH、MDA和TG水平 Tab.3 Levels of GSH,MDA,and TG in liver tissue of mice in various groups
(±s)
GroupnGSH [wB /(mg·g-1)]MDA [mB /(μmol·g-1)]TG [cB /(mmol·L-1)]
Control105.47±1.628.59 ±4.080.18±0.04
Model 91.87±0.53 * 35.06 ±18.91 * 1.13±0.19 *
DECB
Low 102.35±0.7819.39±11.19 △ 0.74±0.34 △
Medium 103.92±1.64 △ 19.34 ±8.55 △ 0.51±0.27 △
High 82.99±0.87 △ 17.76 ±6.06 △ 0.63±0.25 △
Positive drug104.20±0.93 △ 15.72±11.41 △ 0.42±0.36 △
* P＜0.05 vs control group; △ P＜0.05 vs model group.
表选项
2.4 各组小鼠肝脏组织病理学表现

光镜下观察，对照组小鼠肝组织中肝细胞排列整齐，核仁清晰，肝细胞内胞浆丰富，呈红色，细胞核呈圆形，核内染色质呈现蓝色，肝窦大小正常，肝脏无异常病理改变；模型组小鼠肝组织可见肝索紊乱、胞质疏松，肝细胞呈现不同程度的变性改变，大量肝细胞表现为水样变性，细胞浆疏松呈网状结构，呈现淡红色，胞质内可见大小不一的脂滴空泡，可见淋巴细胞浸润，未见明显肝纤维化改变；不同剂量DECB组小鼠肝组织可见散在水样变性细胞，程度较模型组减轻，细胞轻度肿大。见图1(插页四)。

3 讨 论

长期大量酒精摄入可引起酒精性肝病，其发病机制尚不清楚。近年来，学术界普遍认为氧化应激在酒精性肝损伤中起重要作用[8, 9]。在酒精氧化过程中消耗大量GSH，产生大量氧自由基(OH－、O2－、H2O2)，引起氧化应激和线粒体功能障碍，进一步干扰脂肪酸代谢，加重脂肪积累，加速肝脏内细胞死亡[10, 11, 12, 13, 14]。本研究中酒精性肝损伤模型小鼠出现严重的酒精代谢导致的肝损伤，显示肝组织脂肪变性以及血清ALT和AST活性明显升高，肝组织中TG水平明显升高，出现脂肪变性；同时，肝脏发生较强的氧化应激，肝组织中GSH水平明显降低，脂质过氧化物MDA水平肝组织中明显升高；而DECB能明显降低血清ALT和AST活性和肝组织中TG和MDA水平，明显升高小鼠肝组织中GSH水平，提示DECB可以通过降低肝脏氧化应激程度改善酒精代谢所导致的急性肝损伤。DECB中起作用的主要成分为磷酸肌醇寡糖和小分子激活肽，其能够促进细胞对葡萄糖和氧的摄取和利用(不依赖于胰岛素),促进线粒体呼吸，从而提高ATP的周转，为细胞提供较高的能量。在低血氧以及能量需求量增加的情况下使葡萄糖的无氧代谢转向为有氧代谢,抑制乳酸合成,及时恢复肝脏必需的有氧代谢和能量供应,阻止受损肝组织细胞的进一步恶化,延长细胞生存时间,增加供血量[15, 16, 17, 18]。

综上所述，高剂量DECB对急性酒精性肝损伤有较明显的保护作用，可减轻酒精对肝脏的脂质过氧化损伤，降低血清转氨酶和TG水平，改善肝脏的组织病理学损伤，其作用机制可能是通过促进细胞对氧的摄取,促进血中葡萄糖进入细胞,明显延长缺氧细胞的生存时间,改善能量代谢，增强GSH对活性氧簇的清除能力，从而减轻酒精对肝细胞的直接损害，保护肝细胞并恢复肝功能。

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