吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (04): 711-715

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陈雪, 张玉影, 邵玉, 张璐妮, 宁明杰, 唐英, 齐玲, 李蕴潜
CHEN Xue, ZHANG Yuying, SHAO Yu, ZHANG Luni, NING Mingjie, TANG Ying, QI Ling, LI Yunqian
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 711-715
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(04): 711-715
10.13481/j.1671-587x.20160415

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收稿日期: 2015-10-14
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陈雪, 张玉影, 邵玉, 张璐妮, 宁明杰, 唐英, 齐玲, 李蕴潜. 五味子甲素对脑胶质瘤C6细胞生长的抑制作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 711-715.
CHEN Xue, ZHANG Yuying, SHAO Yu, ZHANG Luni, NING Mingjie, TANG Ying, QI Ling, LI Yunqian. Inhibitory effect of deoxyschizandrin on growth of brain glioma cells and its mechanism[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(04): 711-715.
五味子甲素对脑胶质瘤C6细胞生长的抑制作用及其机制
陈雪1, 张玉影2, 邵玉2, 张璐妮2, 宁明杰2, 唐英2, 齐玲2 , 李蕴潜3     
1. 吉林医药学院实验中心, 吉林 吉林 132013;
2. 吉林医药学院病理教研室, 吉林 吉林 132013;
3. 吉林大学第一医院神经外科, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2015-10-14;
基金项目: 吉林省科技厅科研项目资助课题（20140414049GH，20140101114JC）；吉林省教育厅科研项目资助课题（2016236）；吉林省卫计委科研项目资助课题（2014Z104）
作者简介: 陈雪(1981-),女,吉林省吉林市人,实验师,医学硕士,主要从事抗肿瘤药物方面的研究。
通信作者: 齐玲,副教授,硕士研究生导师(Tel:0432-64560027,E-mail:qiling1718@163.com);李蕴潜,副教授,硕士研究生导师(Tel:0431-85933066,E-mail:yunqianli@gmail.com)
摘要: 目的：探讨五味子甲素对脑胶质瘤C6细胞生长的抑制作用，阐明其作用机制。方法：培养大鼠脑胶质瘤C6细胞，将其分为对照组及50、100和200mg·L-1五味子甲素组，采用MTT法检测C6细胞增殖率，流式细胞术分析细胞周期百分率，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清中CyclinD1、Bax、Bcl-2和Casepase-3蛋白表达水平。结果：与对照组比较，24和48h时50、100和200 mg·L-1五味子甲素组细胞增殖率均明显降低（P <0.01），72h时100和200 mg·L-1五味子甲素组细胞增殖率明显降低（P <0.05或P <0.01）。与对照组比较，200 mg·L-1五味子甲素组SubG1期细胞百分率升高（P <0.05），S期细胞百分率降低（P <0.05）。与对照组比较，100和200mg·L-1五味子甲素组细胞CyclinD1蛋白表达水平降低（P <0.01），不同浓度五味子甲素组Bax蛋白表达水平升高（P <0.05或P <0.01），200mg·L-1五味子甲素组Bcl-2蛋白表达水平降低（P <0.01），不同浓度五味子甲素组Bax/Bcl-2比值明显升高（P <0.01），200 mg·L-1五味子甲素组Caspase-3蛋白表达水平升高（P <0.01）。结论：五味子甲素通过下调CyclinD1蛋白表达水平、上调促凋亡因子Bax和Bcl-2表达水平而抑制C6细胞的生长。
关键词: 五味子甲素    胶质瘤细胞    CyclinD1    Bax    Bcl-2    
Inhibitory effect of deoxyschizandrin on growth of brain glioma cells and its mechanism
CHEN Xue1, ZHANG Yuying2, SHAO Yu2, ZHANG Luni2, NING Mingjie2, TANG Ying2, QI Ling2 , LI Yunqian3     
1. Experiment Center, Jilin Medical University, Jilin 132013, China;
2. Department of Pathology, Jilin Medical University, Jilin 132013, China;
3. Department of Neurosurgery, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China
Abstract: Objective: To study the inhibitory effect of deoxyschizandrin on the growth of brain glioma C6 cells,and to explore its mechanism. Methods: The rat glioma C6 cells were cultured and divided into control group,50,100,and 200 mg·L-1 deoxyschizandrin groups. The proliferation rates of C6 cells were examined by MTT assay;the changes of cell cycles were examined by flow cytometry;the expression levels of CyclinD1,Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins in supernant were detected by ELISA assay. Results: Compared with control group,the proliferation rates at 24 and 48 h in 50,100, and 200 mg·L-1 deoxyschizandrin groups were significantly decreased(P <0.01),and the proliferation rates at 72 h in 100 and 200 mg·L-1 deoxyschizandrin groups were significantly decreased(P <0.05 or P <0.01).Compared with control group,the percentage of cells at SubG1 phase in 200 mg·L-1 deoxyschizandrin group was increased (P <0.05),and the percentage of cells at S phase was decreased (P <0.05). Compared with control group,the expression levels of CyclinD1 in 100 and 200 mg·L-1deoxyschizandrin groups were decreased (P <0.01 );the expression levels of Bax protein in deoxyschizandrin groups were increased(P <0.05 or P <0.01),and the expression level of Bcl-2 protein in 200 mg·L-1 deoxyschizandrin group was decreased(P <0.01),and the Bax/Bcl-2 value in deoxyschizandrin groups were increased(P <0.01 );the expression level of Caspase-3 protein in 200 mg·L-1 deoxyschizandrin group was increased(P <0.01). Conclusion: Deoxyschizandrin could inhibit the growth of glioma cells through down-regulating the expression levels of CyclinD1 protein and up-regulating the expression levels apoptotic factors Bax and Bcl-2.
Key words: deoxyschizandrin    glioma cells    CyclinD1    Bax/Bcl-2    

五味子是木兰科植物五味子或华中五味子的干燥成熟果实,含有五味子甲素等木脂素类化合物。五味子具有补肾涩精、收敛止泻的功效[1],故为著名的滋补性中药。脑胶质瘤为中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤,其恶性程度高[2]。胶质瘤常呈浸润性生长,边界不清,故手术难以根除,且具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的特点,目前仍缺乏满意的治疗手段。本课题组前期研究[3]显示:五味子提取物可以抑制胶质瘤的生长,而五味子甲素是否有抗胶质瘤作用国内外尚未见相关报道。本文作者通过研究五味子甲素对体外培养大鼠脑胶质瘤C6细胞生长的影响,旨在探讨五味子甲素对脑胶质瘤细胞生长的作用及其机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

RPMI-1640培养液(美国Hyclone公司),0.25%胰酶和小牛血清(美国Gibco公司),二甲基亚枫(DMSO)和噻唑蓝(MTT)(美国Sigma公司),Bax、Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1抗体(北京中杉公司)。CB150型CO2培养箱(德国Binder公司),J-26XP型超低温高速离心机(美国贝克曼公司),PLUS 384型全自动酶标仪(美国MDC公司),IX-70型倒置式显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 细胞分组与处理

取生长状态良好的脑胶质瘤C6细胞(由吉林医药学院科研实验室提供)制成单细胞悬液,按8×103个细胞密度将其接种于96孔细胞培养板中,置于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养过夜。分别于24、48和72 h 弃去上清液,加入200 μL不同浓度( 0、50、100和200 mg·L-1)的五味子甲素,进行MTT检测。再将1×107个细胞接种于25 cm2培养瓶中,分别用不同浓度( 0、50、100和200 mg·L-1)五味子甲素作用24 h,用于流式细胞术检测和酶联免疫吸附实验(ELISA)。每组设5个复孔,0 mg·L-1 五味子甲素组为对照组。

1.3 MTT法检测C6细胞增殖率

各组细胞培养24、48和72 h,实验终止前每孔加入20 μL MTT并继续孵育4 h,弃去上清液后,每孔分别加入150 μL DMSO,振荡10 min后于全自动酶标仪上测定各孔490 nm处的吸光度(A)值,细胞增殖率=药物组A值/对照组A值×100%。

1.4 流式细胞术测定细胞周期百分率

磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤及重悬各组细胞,台盼兰计数活细胞,80%冷甲醇-20℃固定过夜。次日1000r·min-1离心5 min,PBS再次洗涤细胞,调整细胞密度1×107mL-1,取100 μL细胞悬液至流式管内,加入PI溶液400 μL,混匀后避光孵育30 min,300目尼龙筛网过滤。用流式细胞仪检测细胞周期百分率,WinMDI软件分析结果。

1.5 C6细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1蛋白表达水平

取细胞培养上清,将上清液与包被液按1∶1的比例包被后4℃过夜封闭,然后分别加入一抗Bax、Caspase-3、Bcl-2和CyclinD1(1∶1000稀释)于4℃过夜。加入二抗(1∶1000稀释)室温下孵育2h,加显色液室温避光显色后于自动酶标仪492 nm处测定A值,根据标准曲线计算蛋白表达水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。细胞增殖率、细胞周期百分率和C6细胞培养上清中Bax、Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1蛋白表达水平均以±s表示,组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 五味子甲素作用不同时间后各组C6细胞增殖率

50、100和200 mg·L-1五味子甲素作用于C6细胞24和48h时,细胞增殖率均明显降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。50、100和200 mg·L-1五味子甲素作用于C6细胞72 h时,细胞增殖率亦明显降低,与对照组比较,100和200 mg·L-1五味子甲素组差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。不同浓度五味子甲素作用于胶质瘤C6细胞24 h时对细胞增殖的抑制作用最明显(IC50=249.33 mg·L-1),因此后续实验均采用这一时间点。见图1。

* P＜0.05,** P＜0.01 vs control group. 图1 五味子甲素作用不同时间后各组C6细胞增殖率 Fig.1 Proliferation rates of C6 cellsafter treated with deoxyschizandrin for different time
图选项
2.2 五味子甲素作用后各组C6细胞周期百分率

50、100和200mg·L-1五味子甲素作用C6细胞后,SubG1期细胞百分率随着药物浓度升高呈上升趋势,与对照组比较,200 mg·L-1五味子甲素组差异有统计学意义(P＜0.05)。G0/G1期细胞百分率也随着五味子甲素浓度的增加呈升高趋势,但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。[CM(22]而S期和G2/M期细胞百分率则随着五味子甲素[CM)][LL]作用浓度的升高呈下降趋势,与对照组比较,200 mg·L-1五味子甲素组S期细胞百分率差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1和图2。

表1 五味子甲素作用后各组C6细胞不同周期细胞百分率 Tab. 1 Percentages of C6 cells at different cell cycles in various groups after treated with deoxyschizandrin
(n=3,±s,η/%)
GroupDose(mg·L-1)Percentage of C6 cells
G2/MSubG1G0/G1S
Control 01.03±0.1265.23±1.5522.11±1.0311.63±3.32
Deoxyschizandrin
506.98±0.3866.85±2.3715.38±2.8610.79±1.58
1007.80±0.7868.66±3.5314.25±4.549.29±0.39
20012.74±1.25*69.50±3.1811.40±2.12*6.36±1.21
*P＜0.05 vs control group
表选项

图2 五味子甲素作用后各组C6细胞的流式细胞图 Fig.2 Flow cytometry diagram of C6 cells in various groups after treated with deoxyschizandrin
图选项
2.3 五味子甲素作用后各组C6细胞培养上清中相关蛋白表达水平

随着药物浓度的升高,肿瘤细胞Bax蛋白表达水平明显升高,与对照组比较,不同浓度五味子甲素组差异均有统计学意义(P＜0.05 或P＜0.01);Bcl-2蛋白表达水平呈下降趋势,与对照组比较,200 mg·L-1五味子甲素组差异有统计学意义(P＜0.01);随着药物浓度升高,Bax/Bcl-2比值升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。不同浓度五味子甲素组Caspase-3蛋白表达水平升高,与对照组比较,200 mg·L-1五味子甲素组差异有统计学意义(P＜0.01);CyclinD1蛋白表达水平呈下降趋势,与对照组比较,100和200mg·L-1五味子甲素组差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 各组C6细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3和CyclinD1蛋白表达水平 Tab. 2 Expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3,and CyclinD1proteins in C6 cells in various groups
(n=3,±s)
GroupDose(mg·L-1)BaxBcl-2Bax/Bcl-2Caspase-3CyclinD1
Control00.71±0.062.34±0.100.31±0.061.60±0.482.12±0.08[BHDW
Deoxyschizandrin
501.26±0.04*2.20±0.020.57±1.28** 1.73±0.491.74±0.10
1001.41±0.09** 2.18±0.260.64±0.03** 1.75±0.251.44±0.11**
2001.42±0.07** 1.55±0.01** 0.91±0.05** 2.05±0.48** 1.21±0.09**
*P＜0.05,** P＜0.01 vs control group
表选项
3 讨 论

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均很高,且病程难以控制[4]。肿瘤的共同生物学特征是失控性生长,其主要的分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增生过多和凋亡减少,但目前治疗方案仍只是以手术切除为主,并辅以放疗和化疗等,因此抑制肿瘤细胞增殖,诱导其凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段之一[5]。五味子具有抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用部分主要集中在木脂素和多糖部位[6, 7]。五味子甲素为木脂素的主要成分之一,所以,五味子甲素也可能具有抗肿瘤作用。本研究结果显示:不同浓度五味子甲素均可以明显抑制胶质瘤C6细胞的生长,且具有明显的浓度依赖效应。

细胞增殖是通过细胞周期来实现的,本实验通过流式细胞术检测细胞周期结果显示:SubG1期和G0/G1期细胞百分率随着五味子甲素浓度的增加而呈现增加的趋势,而S期和G2/M期细胞百分率呈下降趋势。说明五味子甲素既可以诱导细胞发生凋亡,又可以抑制细胞进入DNA合成前期,使细胞的生长受到阻滞。而细胞周期受细胞周期蛋白(Cyclins)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的调控。在众多的细胞周期蛋白中,CyclinD1对细胞的生长具有正向的调节作用[8, 9]。本研究结果显示:五味子甲素作用于C6细胞后,细胞分泌CyclinD1蛋白水平呈明显下降的趋势,因此五味子甲素可能是通过下调CyclinD1蛋白表达,使细胞周期受到阻滞。

细胞凋亡是一种广泛存在于生理和病理状态下的程序化死亡,目前已发现许多与凋亡相关的基因,其中Bax和Bcl-2是一对凋亡的重要调控因子[10]。研究[11]表明:当Bcl-2蛋白表达增加时,在细胞内可形成Bcl-2/Bax异源二聚体,抑制凋亡的产生;当Bax表达加强时则促进Bax/Bax同源二聚体的形成从而加速细胞凋亡。因此Bax/Bcl-2比例对细胞的凋亡与否起决定性的作用[12]。当Bax/Bcl-2比值升高时,Bax激活引起线粒体膜上大孔通道开放,线粒体内细胞色素C等蛋白释放[13, 14]。线粒体蛋白释放会激活Caspase-3,Caspase-3是凋亡的"执行者"[15]。活化的Caspases-3再激活或者破坏下游的某些酶,导致特征性DNA断裂,最终引起凋亡发生[16]。本研究结果显示:随着药物作用浓度的升高,不同浓度五味子甲素组细胞分泌Bax蛋白增加,分泌Bcl-2蛋白减少,Bax/Bcl-2比值升高。因此五味子甲素可以增加C6细胞促凋亡因子的分泌,使得促凋亡因子占优势,下游Caspase-3表达增加也间接证实了凋亡通路的激活,但这还需要进一步检测活化Caspase-3情况才能最终确认。

参考文献
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