吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (04): 699-703

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范钰奇, 王明华, 谢东雪, 崔雪玲, 葛敬岩
FAN Yuqi, WANG Minghua, XIE Dongxue, CUI Xueling, CUI Xueling
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 699-703
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(04): 699-703
10.13481/j.1671-587x.20160413

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收稿日期: 2016-01-25
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范钰奇, 王明华, 谢东雪, 崔雪玲, 葛敬岩. 激活素A通过下丘脑室旁核调节动脉压的作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(04): 699-703.
FAN Yuqi, WANG Minghua, XIE Dongxue, CUI Xueling, CUI Xueling. Effect of activin A on regulation of arterial blood pressure by hypothalamic paraventricular nucleus and its mechanism[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(04): 699-703.
激活素A通过下丘脑室旁核调节动脉压的作用及其机制
范钰奇1, 王明华1, 谢东雪2, 崔雪玲2, 葛敬岩1     
1. 吉林大学基础医学院生理学系, 吉林 长春 130021;
2. 吉林大学基础医学院遗传学系, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2016-01-25;
基金项目: 吉林省科技厅国际合作基金资助课题（20130413001GH）
作者简介: 范钰奇(1990-),女,河南省漯河市人,医学硕士,主要从事神经生理学方面的研究。
通信作者: 葛敬岩,副教授,硕士研究生导师(Tel:0431-85619472,E-mail:gejy@jlu.edu.cn)
摘要: 目的：探讨激活素A在WKY大鼠下丘脑室旁核（PVN）中的表达及其对动脉压的影响，阐明激活素A通过PVN调节动脉压的作用机制。方法：选用WKY大鼠，采用RT-PCR法检测激活素A、激活素Ⅱ型受体（ActRⅡA和ActRⅡB）和信号传导蛋白Smads mRNA在PVN中的表达情况，免疫组织化学染色检测ActRⅡA蛋白在PVN中的表达情况。PVN核团微量注射外源性激活素A，观察给药前后大鼠动脉压的变化。原代培养WKY大鼠PVN神经元，分为对照组和激活素A处理组，RT-PCR法检测PVN神经元中ActRⅡA、ActRⅡB和Smads mRNA表达水平。结果：WKY大鼠PVN中存在激活素A及其受体、Smad2和Smad3 mRNA表达，免疫组织化学染色检测，PVN神经元表达ActRⅡA蛋白。PVN微量注射血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）或激活素A后，与给药前比较，大鼠平均动脉压明显升高（P <0.05）。与对照组比较，激活素A处理组大鼠体外原代培养PVN神经元中ActRⅡA和Smad3 mRNA表达水平明显升高（P <0.05）。结论：激活素A以自分泌/旁分泌形式通过PVN调控动脉压，其作用与ActRⅡA-Smad3信号传导途径有关。
关键词: 动脉血压    下丘脑室旁核    激活素A    Smad蛋白    
Effect of activin A on regulation of arterial blood pressure by hypothalamic paraventricular nucleus and its mechanism
FAN Yuqi1, WANG Minghua1, XIE Dongxue2, CUI Xueling2, CUI Xueling1     
1. Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China;
2. Department of Genetics, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China
Abstract: Objective: To investigate the expression of activin A in paraventricular nucleus (PVN) of the WKY rats and its influence in arterial blood pressure,and to clarify the mechanism of activin A in the regulation of arterial blood pressure by PVN. Methods: The WKY rats were selected. The expressions of activin A,ActRⅡA,ActRⅡB,and Smads mRNA in PVN of the WKY rats were measured by RT-PCR. The expression of ActRⅡA protein in PVN was detected by immunohistochemical staining. The microinjection of exogenous activin A into PVN was used to observe the changes of arterial blood pressure. The primary cultured PVN neurons from the WKY rats were divided into control group and activin A group. The mRNA expression levels of ActRⅡA,ActRⅡB, and Smads in the PVN neurons were analyzed by RT-PCR. Results: Activin A,ActRⅡA,ActRⅡB,Smad2 and Smad3 mRNA were expressed in PVN of the WKY rats. The ActRⅡA protein expression in PVN was further confirmed by immunohistochemical staining. After microinjection of activin A or angiotensin Ⅱ (AgⅡ) into PVN,the mean arterial blood pressure was increased obviously compared with before treatment (P <0.05). Moreover,compared with control group,the expression levels of ActRⅡA and Smad3 mRNA in primary cultured PVN neurons of the rats in vitro were significantly increased(P <0.05). Conclusion: Activin A can regulate the arterial blood pressure in PVN in an autocrine or paracrine manner,which is related to ActRⅡA-Smad3 signal pathway.
Key words: arterial blood pressure    paraventricular nucleus    activin A    drosophia mothers against decapentaplegic protein    

高血压的发生是多系统参与的复杂的整合过程,目前认为遗传因素、精神因素以及肾素血管紧张素系统、饮食和环境等因素均参与了高血压的形成过程[1, 2]。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是自主神经反应和神经内分泌的重要整合中枢,在维持动脉压的稳态中发挥重要作用[3],但是PVN调节动脉压的分子机制尚未阐明。激活素A属于转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)超家族成员,在机体正常发育过程中广泛表达[4, 5]。研究[6, 7, 8]显示:激活素A能够促进神经元释放5-羟色胺(5-HT),并具有增加神经元Na+电流的作用。激活素通过与抗激活素Ⅱ型受体(ActRⅡ)结合,再招募Ⅰ型受体(ActRⅠ)并使其磷酸化而活化,进而激活下游的Smad2/3传导细胞内信号[9]。已有研究[10, 11]显示:肺动脉高压患者及先兆子痫患者血清中激活素A水平升高,但激活素A能否通过PVN参与动脉压调节,尚未见相关报道。本研究利用WKY大鼠分析激活素A、ActRⅡ及Smads在PVN的表达及其对动脉压的影响,阐明激活素A通过PVN对动脉压的调节作用及可能机制。

1 材料与方法 1.1 动 物

30只SPF级WKY大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2011-0011],所有实验均符合吉林大学关于实验动物管理条例。

1.2 主要试剂

激活素A及抗激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)单克隆抗体由美国R&D公司提供,Neurobasal和B-27培养液购于美国G ibco公司,血管紧张素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)和L-多聚赖氨酸购自美国Sigma公司,一步法逆转录PCR试剂盒由宝生物工程有限公司(大连)提供。

1.3 RT-PCR法检测大鼠PVN神经元中ActRⅡ和Smads mRNA表达水平

Trizol试剂提取大鼠PVN组织或体外原代培养的PVN神经元中总RNA,采用一步法RT-PCR扩增特异cDNA片段,2%琼脂糖凝胶电泳,采用凝胶成像系统分析扩增的cDNA片段,以β-actin做为内参照,以目的基因/β-actin灰度值比值表示目的基因mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列 Tab. 1 Primer sequences of RT-PCR
GeneForward(5'-3')Reverse(5'-3')Size(bp)
Activin Aggatgtgcggattgcttgtgagaccttgccatcacactccaa235
ActRⅡAgacagaaccaatcagactggttgtgtgacttccatctccggaa254
ActRⅡBgctgctggctagatgacttcagatgtcggtacatccagaagg261
Smad2aggtggtggagaacagaatgggacacctgaagacgaccatca270
Smad3cggtcaagagcttggtgaagaaaggcgaactcacagagctcc238
β-actinaccaactgggacgatatggagatgccagtggtacgaccagag224
表选项
1.4 免疫组织化学染色检测大鼠PVN中ActRⅡA蛋白表达

大鼠麻醉处死后进行心脏灌流,断头取脑组织于4%多聚甲醛中固定24h,脑组织冠状切片,石蜡包埋PVN核团部位脑组织,常规组织切片、脱蜡、透明及水化。3%过氧化氢室温孵育30 min,再应用3%牛血清白蛋白封闭30 min,加入抗ActRⅡA单克隆抗体4°C过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,加入生物素标记的二抗室温孵育10 min;PBS洗3次,再加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素室温孵育10 min;PBS洗3次,然后加入新鲜配制的DAB液进行显色,苏木素复染,二甲苯透明,中性树胶封固,光学显微镜下观察染色情况。以同型IgG作为阴性对照,操作同抗体组。

1.5 大鼠PVN微量注射及动脉压监测

3%戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg·kg-1)麻醉大鼠,股动脉插管,PowLab监测动脉血压,将大鼠固定于脑立体定位仪,根据Paxinos和Watson的大鼠立体定位图谱,定位PVN核团三维坐标(AP:-1.78 mm,RL/LL:0.5 mm,DV:8 mm)。取100nL激活素A(20 μg·L-1)或AngⅡ(100 pmol·L-1)缓慢注射于大鼠PVN内,观察各组大鼠动脉压变化。每次实验结束后,将50 nL伊文思蓝注射于同一位置以验证PVN定位是否准确。

1.6 大鼠PVN原代神经元培养及其ActRⅡA、ActRⅡB和Smads mRNA表达水平检测

新生24h内的WKY大鼠,无菌环境取脑组织,分离PVN所在部位,剪碎组织块,0.25%胰酶消化组织20 min,加入100 μLDNA酶,10%牛血清DMEM终止消化,200目钢网过滤细胞后进行离心,重悬细胞,计数,以每孔5×105个细胞接种于预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板中,4h后换神经元维持培养液(neurobasal medium+1% B27),培养7~10 d。以无血清培养液洗细胞 2次,再加入2%牛血清DMEM配置的激活素A 2.5 和5.0 μg·L-1,同时设培养液对照组,继续培养12 h,回收细胞RNA,用于RT-PCR扩增目的基因。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。大鼠平均动脉压及PVN中ActRⅡA、ActRⅡB和Smads mRNA表达水平以±s表示,组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 大鼠PVN中激活素A、激活素受体及Smads mRNA的表达

RT-PCR法检测结果:WKY大鼠PVN中均有激活素A、ActRⅡA、ActRⅡB、Smad2和Smad3 mRNA的表达(图1)。

Lane1:DNA marker;Lane2:β-actin;Lane 3:Activin A;Lane 4:ActRⅡA;Lane 5:ActRⅡB;Lane 6:Smad2;Lane 7:Smad3. 图1 大鼠PVN中激活素A、激活素受体及Smad2和Smad3 mRNA表达电泳图 Fig.1 Electrophoregram of expressions of activin A,ActRⅡA,ActRⅡB,Smad2,and Smad3 mRNA in PVN of rats
图选项
2.2 大鼠PVN中ActRⅡA蛋白的表达

采用免疫组织化学染色方法观察ActRⅡA蛋白在WKY大鼠PVN中的表达。与IgG阴性对照组比较,抗ActRⅡA抗体组神经细胞上可见棕黄色颗粒(图2,见插页二),表明ActRⅡA蛋白在大鼠PVN神经元中有表达,该结果与mRNA检测结果一致。

2.3 大鼠PVN核团微量注射激活素A后大鼠平均动脉压

作为阳性对照的AngⅡ注射组,大鼠PVN注射AngⅡ后血压明显升高,平均动脉压由给药前(88.7±3.0)kPa升高到(100.0±5.3)kPa;激活素A注射组大鼠平均动脉压由给药前(86.3±3.8)kPa升高到(96.3±4.5)kPa(图3)。与给药前比较,给药后2组大鼠平均动脉压均明显升高(P＜0.05)。

图3 大鼠PVN注射AngⅡ(A)和激活素A(B)后平均动脉压 Fig.3 Mean of arterial blood pressure of rats after injection of AngⅡ(A) and activin A(B) into PVN
图选项
2.4 大鼠原代培养PVN神经元中ActRⅡA、ActRⅡB和Smads mRNA表达水平

与对照组比较,不同浓度激活素A处理组原代培养PVN神经元中ActRⅡA和Smad3 mRNA表达水平明显升高(P＜0.05),而ActRⅡB和Smad2 mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)。见图4和5。

Lane 1:Control group;Lane 2:Activin A 2.5 μg·L-1 group; Lane 3:Activin A 5.0 μg·L-1 group. 图4 大鼠原代培养PVN神经元中ActRⅡA、ActRⅡB、Smad2和Smad3mRNA表达电泳图 Fig.4 Electrophoregram of expressions of ActRⅡA,ActRⅡB,Smad2,and Smad3 mRNA in primary cultured PVN neurons of rats
图选项

1:Control group;2:Activin A 2.5 μg·L-1 group;3:Activin A5.0 μg·L-1 group;*P<0.05 vs control group. 图5 大鼠原代培养PVN神经元中ActRⅡA(A)、ActRⅡB(B)、Smad2(C)和Smad3(D) mRNA表达水平直条图 Fig.5 Histogram of expression levels of ActRⅡA(A),ActRⅡB(B),Smad2(C),and Smad3(D) mRNA in PVN neurons of rats
图选项
3 讨 论

激活素A属于TGF-β超家族,在调节细胞分化、凋亡和胚胎发生过程中发挥重要作用,机体发育过程中激活素A及其信号传导异常将导致形态学缺陷和过早死亡[12, 13]。激活素A参与了多种疾病的过程,心衰、肺动脉高压和先兆子痫患者血清中激活素A水平明显升高,且升高水平与疾病的严重程度和死亡率有关联[10, 11]。有研究[14, 15]显示:TGF-β超家族中的TGF-β1水平与高血压患者的动脉血压呈正相关关系,降低TGF-β1能够降低高血压的程度。尽管大量研究表明TGF-β1参与了动脉压的调节,但TGF-β超家族的激活素A是否直接参与了动脉压的调节仍不清楚。

激活素A及其受体在脑组织中广泛表达,特别是下丘脑,提示激活素A在下丘脑对神经功能调节具有潜在性和多样性。激活素A具有神经保护作用,能够延长神经元的存活和减轻神经元损伤。激活素A还通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)增加原代培养海马神经元Ca2+ 内流,调节突触的可塑性[16]。本课题组前期研究[7]发现:激活素A能够增加神经元Na+电流调节神经元的兴奋性,但其通过PVN对动脉压的调节作用尚不清楚。本文作者检测激活素A及其受体在WKY大鼠PVN中表达的结果显示:激活素A及其受体ActRⅡA和ActRⅡB mRNA在大鼠PVN中均有表达,同时免疫组织化学染色进一步证实ActRⅡA蛋白在大鼠PVN中表达,与mRNA的结果一致,提示激活素A可能通过自分泌/旁分泌形式参与PVN神经元功能调控。为了确定激活素A在PVN中的作用,本研究采用PVN微量注射外源性激活素A观察大鼠动脉压变化的结果显示:作为阳性对照的AngⅡ注射PVN后大鼠血压可以明显升高,同样激活素A注射PVN后大鼠血压也明显升高,提示激活素A可能通过PVN调控机体动脉压。

Smads蛋白是介导TGF-β超家族信号传导的主要蛋白,其中Smad2和Smad3负责传导激活素/ TGF-β信号,Smad1、Smad5和Smad8则负责骨形成蛋白(BMP)信号传导,而Smad4是TGF-β超家族共同的信号传导蛋白[17]。为了确定激活素A调控PVN神经元的作用是否与Smad信号传导途径有关,本研究采用RT-PCR法检测Smad2及Smad3mRNA在WKY大鼠PVN中表达的结果显示:Smad2及Smad3 mRNA在大鼠PVN中均有表达;进一步采用原代培养PVN神经元观察激活素A对其信号分子表达影响的结果显示:激活素A可以明显上调原代培养PVN神经元中ActRⅡA和Smad3 mRNA表达,而对ActRⅡB和Smad2 mRNA表达无明显影响,提示激活素A可能通过ActRⅡA-Smad3依赖途径影响PVN神经元活性,进而使大鼠血压升高。

综上所述,激活素A及其受体在PVN中表达,可能通过自分泌/旁分泌形式作用于PVN调控动脉压,其升压作用与ActRIIA-Smad3信号传导途径有关。

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