牙周炎是一种由牙周致病菌所致的牙周组织慢性炎症性和破坏性疾病 ^[1]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是目前公认的主要牙周致病菌之一，其分泌的多种毒力因子可抑制成骨细胞的成熟和分化，对牙周组织产生破坏作用^[2]。因此，抵御Pg对成骨细胞的影响，对临床治疗牙周炎具有重要意义。

MT01是一种依据人线粒体DNA序列设计的具有选择性免疫负调节活性的单链寡脱氧核苷酸，可靶向阻断由Toll样受体9(Toll-like receptors-9，TLR9)激活的信号通路，从而维持机体的免疫平衡状态^[3]。目前研究^[4]已证实：MT01能抑制牙周炎大鼠牙槽骨吸收。MT01可通过上调细胞内成骨相关基因Runx2、SP7等促进成骨细胞成骨向分化^{[5, 6]}。MT01 作为一种免疫抑制性单链寡脱氧核苷酸，是否影响感染状态下成骨细胞的成骨分化尚未见报道。本课题组近期研究^[7]表明：Pg感染MG63细胞后，细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性增强，成骨相关因子Runx2和SP7 mRNA表达水平升高。本文作者主要探讨在Pg感染状态下，MT01对成骨细胞中Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)表达的影响及其意义，进一步补充说明MT01对感染的成骨细胞的成骨作用。

MT01(5′-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3′) 由吉林大学基础医学院分子生物学教研室设计，大连TaKaRa公司合成。高糖DMEM和0.25%胰酶(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，组织细胞总RNA抽提试剂盒(广州Magen公司)，逆转录试剂盒和Real-time 聚合酶链反应 (RT-PCR)试剂盒(大连TaKaRa公司)。NanoDrop 1000 Spectrophotometer(美国Thermo Scientific公司)，Mx3005P荧光定量RCR仪(美国Stratagene公司)。

选择人成骨细胞系MG63细胞作为实验细胞，复苏后接种于含10%胎牛血清高糖DMEM培养基(37℃、5%CO₂)中。隔日换液，观察细胞生长状态，待细胞铺满底面积约80%时，1mL胰酶消化，加完全培养基充分中和，吹打离心，按1∶2传代培养。采用荧光倒置显微镜观察MG63细胞的生长状态及形态表现。

选择Pg W83(首都医科大学口腔医学院实验室赠送)作为实验菌株，将菌株接种于BHI固态培养板，37℃厌氧产气袋培养5～7d，挑单克隆菌落接种于新鲜配制的BHI液体培养基中培养，取菌悬液，在波长600nm的紫外分光光度计下测细菌密度，调制备用。

取对数生长期MG63细胞，胰酶消化，每孔5×10⁵个细胞接种于6孔板。 细胞分为空白对照组、MT01组、Pg组和MT01+Pg组, 待细胞完全贴壁后换无血清DMEM饥饿培养24h，加入质量浓度为1 mg·L^-1的MT01共孵育3 h后(空白对照组加等体积1 mg·L^-1PBS)，以感染复数(MOI)=100∶1加Pg菌悬液(对照组加等体积1 mg·L^-1PBS)，分别共孵育2、4、6、8、12和24 h。

使用Hipure Total RNA Mini Kits细胞RNA快速提取试剂盒，按照试剂盒说明，分别于培养2、4、6、8、12和24 h时提取细胞总RNA。NanoDrop ^{○ R} ND-1000型分光光度计测定RNA浓度(单位 μg·L^-1)。按照逆转录试剂盒说明书逆转录总RNA为cDNA，－20 ℃冻存备用。采用RT-PCR法检测不同时间点各组MG63细胞中ColⅠ mRNA表达水平。RT-PCR引物的基因序列见表1。RT-PCR反应体系：上、下游引物(10 μmol·L^-1)各0.5 μL，Dye Ⅱ 0.5 μL，cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，蒸馏水补总体积至25 μL,测定Ct值，确认反应的扩增曲线和溶解曲线，生成曲线应为完全单一峰。以GAPDH为内参基因，通过相对定量2^-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参基因表达的倍数，比较基因表达的差异。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。 MC63细胞中ColⅠ mRNA表达水平以±s表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

荧光倒置显微镜下观察：MG63细胞生长状态良好，呈长梭形，细胞浆透明，细胞体丰满，胞核呈圆形或椭圆形(图1，见插页二)。

Pg于BHI固态培养板上厌氧培养5～7d后，肉眼可观察到典型的黑色菌落(图2，见插页二)。

与空白对照组比较，在2、4和6h时MT01组MG6细胞中 ColⅠ mRNA表达水平较低，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；8、12和24 h时其表达水平均升高，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表2。

表2 各组MG63细胞中ColⅠ mRNA表达水平 Tab.2 Expression levels of ColⅠ mRNA in MG63 cells in various groups

(n=3,±s)
Group	Col Ⅰ mRNA
	(t/h) 2	4	6	8	12	24
Blank control	1.009±0.192	1.009±0.197	1.002±0.078	1.004±0.128	1.010±0.192	1.000±0.054
MT01	0.218±0.062	0.302±0.003	0.875±0.343	1.038±0.438 * *	1.224±1.042 *	1.342±0.092 * *
Pg	0.015±0.001 *	0.228±0.133 *	0.675±0.343 *	1.263±0.137 * *	1.154±0.388 *	1.128±0.741 *
MT01+Pg	0.186±0.054	0.523±0.372	1.091±0.234 △	1.492±0.248 △△	1.534±0.090 △	1.597±0.848 △△
* P＜0.05, * * P＜0.01 vs blank control group; △ P＜0.05, △△ P＜0.01 vs Pg group.

表选项

与空白对照组比较，Pg组MG63细胞中 ColⅠ mRNA在2、4和6h时呈低表达，在8h时表达水平升高，然而12和24h其表达水平又逐渐降低，组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表2。

与Pg组比较，MT01+Pg组MG63细胞中 ColⅠ mRNA在2、4h时呈低表达(P>0.05)，在6、8、12和24h时ColⅠ mRNA表达水平均升高，其升高趋势随共培养时间的延长而逐渐增强，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表2。

由牙周致病菌引起的牙周炎可导致牙周支持组织炎症性破坏，引发牙槽骨吸收，ColⅠ是构成骨组织有机基质的重要成分，由成骨细胞分泌，参与骨的构建及成骨细胞的发育和分化^[8]，对牙槽骨重塑具有重要作用。 ColⅠ的合成和分泌是成骨细胞活化的重要标志，同时ColⅠ的表达意味着成骨细胞分化成熟且具有骨的功能性^[5]，是成骨细胞分化晚期的标志性因子。本研究结果显示：在共培养8h时，MT01即可上调MG63细胞中ColⅠ mRNA表达水平，且这种促进作用持续至24h时，与本课题组前期研究结论^{[5, 9]}一致，进一步表明MT01可促进成骨细胞成骨向分化。

研究^{[10, 11, 12, 13]}表明：Pg感染成骨细胞后，通过抑制成骨细胞中相关基因的表达，抑制成骨细胞分化和矿化，导致牙周炎牙槽骨丧失。在本实验中，本文作者首先检测了单纯Pg感染对成骨细胞MG63的影响的结果显示：在2、4和6h时Pg组MG63细胞中 ColⅠmRNA表达水平较空白对照组低，在8h时其表达水平升高，然而12和24h时ColⅠ mRNA的表达水平又逐渐降低。结合王艳丽等^[14]研究推测：Pg可能通过调控宿主的某些信号通路，在一定时间内对成骨细胞成骨向分化具有促进作用，但具体机制有待进一步探讨。

为进一步探讨Pg感染状态下MT01对成骨细胞分化的影响，本实验采用Pg侵袭MG63细胞，检测MT01干预下MG63细胞中 ColⅠmRNA表达水平，结果显示：与Pg组比较，在6、8、12和24h时MT01+Pg组MG63细胞中ColⅠ mRNA表达水平均升高，其升高趋势随共培养时间的延长而逐渐增强，表明MT01对感染状态下的成骨细胞骨向分化也具有促进作用。本课题组近期研究^[7]显示:在感染或非感染状态下，MT01可增强MG63细胞中ALP活性，促进SP7和 Runx2等成骨相关因子的表达。

综上所述，MT01对成骨细胞成骨向分化具有促进作用。本研究结果为MT01用于临床治疗感染性牙周疾病导致的牙槽骨吸收提供了实验依据，后续的研究目前正在进行中。