5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸［5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoic acid,NPPB］为常用的氯通道阻断剂,能够阻断囊性纤维跨膜电导调节体、容量调节性氯通道和钙激活的氯通道 ^[1]。研究^{[2, 3, 4]}显示:肿瘤细胞和多种其他细胞在应用NPPB后,可以抑制细胞增殖并能阻断部分药物引起的细胞凋亡。也有研究^{[5, 6]}显示:NPPB可以增加某些化疗药物的促凋亡作用。关于NPPB单独应用对脑胶质瘤细胞的作用及其机制尚未见报道。本研究通过观察NPPB对脑胶质瘤细胞凋亡的作用,旨在为脑胶质瘤的治疗及NPPB的研究开发提供依据。

人脑胶质瘤SHG-44细胞株由吉林大学基础医学院提供。NPPB、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司; NPPB用DMSO配制成0.1 mol·L^-1溶液,4℃保存备用。 β-actin、Bax、Bcl-2和caspase-3抗体均购自北京中杉公司, RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司。

SHG-44细胞复苏后放入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,置于细胞培养箱中,37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下进行培养,隔日换液1次,按1∶3进行传代。

将对数生长期的SHG-44细胞以每孔5×10³个接种于96孔板中,24 h 后加入NPPB(终浓度分别为50、 100和200 μmol · L^-1),分别为50、100和200 μmol · L^-1NPPB组 ,同时设对照组,每个浓度设5个复孔,分别培养3、24和48h后,每孔加入20 μLMTT溶液,继续孵育4 h。弃上清后每孔加150 μL DSMO,震荡摇匀,全自动酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。细胞活力=实验组A值/对照组A值×100%。

取对数生长期的SHG-44细胞,平均接种于4个25 mm²培养瓶中,每瓶1×10⁶个细胞,置入37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。24 h后加入NPPB(终浓度分别为50、100和200 μmol · L^-1),同时设对照组,继续培养48 h。消化后Annexin V/PI染色,流式细胞术检测各样品每10000个细胞中的细胞凋亡率。细胞凋亡率 = 早期凋亡率+ 晚期凋亡率。

SHG-44 细胞接种于24孔板(内置无菌玻片),设对照组和100 μmol· L^-1 NPPB组,培养48 h,多聚甲醛固定。采用SABC法,实验步骤按试剂盒说明书操作,DAB显色。镜下胞浆着色呈棕黄色者为阳性表达。每组每张玻片随机选择5个视野扫描,用Image-Pro Plus分析软件分析蛋白阳性产物的积分吸光度(IA)值,取平均值进行统计学分析。

取对数生长期的SHG-44细胞,平均接种于3个25 mm²培养瓶中,每瓶1×10⁶细胞。培养 48 h后加入NPPB(终浓度分别为50和100 μmol · L^-1),同时设对照组,继续培养48 h。收集细胞至1.5 mL离心管中,离心弃上清,PBS洗涤后每个样品加入40 μL细胞裂解液,充分裂解细胞。12000g 、4℃ 离心15 min,留取上清,测定样品蛋白浓度,行SDS-PAGE分离样品,转膜封闭,加入一抗4℃孵育过夜。加入二抗,室温、避光孵育1h,胶片曝光拍照。采用Quantity One 软件进行灰度分析。以β-actin蛋白为内参,以Bcl-2、Bax蛋白与β-actin蛋白灰度值的比值表示蛋白相对表达水平。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。细胞活力、细胞凋亡率和细胞中凋亡蛋白表达水平以 ±s表示,组间比较采用 t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

SHG-44细胞活力 NPPB作用3h时可促进胶质瘤细胞的生长,与对照组比较,200 μmol·L^-1 NPPB组细胞活力明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。NPPB作用24和48h时,NPPB可以明显抑制胶质瘤细胞的生长,与对照组比较,100和200 μmol·L^-1NPPB组细胞活力明显降低(P＜0.01)。NPPB的作用具有明显的剂量和时间效应。由于48h时抑制效果最为明显,后续实验均采用这一时间。 见表1。

表1 NPPB作用不同时间各组SHG-44细胞的活力 Tab.1 Viabilities of SHG-44 cells in various groups at different time after NPPB treatment

(n=5,±s)
Group	Viabilityof SHG-44 cells
	(t/h)     3	24	48
Control	100.0±9.9	100.0±9.87	100.0±22.9
NPPB(μmol · L-1)
50	95.5±6.2	97.2±13.8	74.8±7.1*
100	114.0±14.6	65.4±3.0**	40.3±2.4**
200	137.8±23.5*	58.0±8.7**	26.6±3.4**
*P＜0.05,**P＜0.01 compared with control group.

表选项

对照组及50、100和200 μmol·L^-1 NPPB组细胞凋亡率分别为(4.17±0.90)%、(4.38±0.79)%、 (24.64±4.17)%和(41.85±9.35)%,与对照组比较,100和200 μmol·L^-1 NPPB组细胞凋亡率明显升高(P＜0.01)。

与对照组比较, 100 μmol·L^-1NPPB作用SHG-44细胞48 h后,Bcl-2蛋白表达水平明显降低 (P＜0.05) ,Bax和Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。见表2。

表2 各组SHG-44细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达水平 Tab.2 Expression levels of Bcl-2,Bax,and caspase-3 in SHG-44 cells in various groups

(n=5,±s)
Group	Bcl-2	Bax	Caspase-3
Control	254.74±69.43	88.70±39.89	165.75±36.37
NPPB(100 μmol·L-1)	124.12±26.60*	244.77±10.99*	267.20±72.59**
*P＜0.05,**P＜0.01 compared with control group.

表选项

各组SHG-44细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平 50、100 μmol·L^-1 NPPB作用SHG-44细胞48 h后,Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平升高,与对照组比较,100 μmol·L^-1 NPPB组差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1和表3。

图1 各组SHG-44细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达电泳图 Fig.1 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax in SHG-44 cells in various groups Lane 1:Control group;Lane 2:50 μmol·L-1 NPPB group; Lane 3:100 μmol·L-1 NPPB group.

图选项

表3 各组SHG-44细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平 Tab.3 Expression levels of Bcl-2 and Bax in SHG-44 cells in various groups

(n=5,±s)
Group	Bcl-2	Bax
Control	0.579±0.010	0.947±0.031
NPPB( μmol·L-1)
50	0.582±0.009	0.969±0.002
100	0.496±0.038*	0.996±0.024*
*P＜0.05 compared with control group.

表选项

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤,世界卫生组织将其分为Ⅰ~Ⅳ级,级别越高恶性程度越高。高级别的胶质细胞瘤占脑胶质瘤的60%,预后极差,平均存活时间不到1年,现有的治疗方法效果不佳。脑胶质瘤经常伴有基因突变(包括原癌基因和抑癌基因)及离子通道的变异。90%的多形性胶质母细胞瘤样品中检测出了离子通道及转运体的变异;小儿脑肿瘤中,33%的患者伴有离子通道及转运体表达上调,48%的患者伴有离子通道及转运体表达下调。因此,离子通道是参与脑胶质瘤发生的潜在基因,有可能成为治疗脑胶质瘤的一个新的靶点^[7]。

本研究结果显示:100和200 μmol·L^-1 NPPB作用SHG-44细胞3h可促进细胞增殖,而作用时间超过24h后可以明显抑制胶质瘤细胞增殖,降低细胞活力,同时100和200 μmol·L^-1 NPPB可以促进细胞凋亡。氯通道分为6 类^[1],分别是电压依赖氯通道、囊性纤维跨膜电导调节体、钙激活氯通道、P64相关氯通道、容量调控氯通道(volume regulated anion channels,VRAC)及配体门控氯通道。NPPB可以阻断囊性纤维跨膜电导调节体、VRAC和钙激活的氯通道。本文作者认为:NPPB的作用主要是通过抑制VRAC产生的。VRAC普遍存在于机体细胞和肿瘤细胞中,在细胞容量调控、增殖、转移和凋亡等进程中均具有十分重要的作用。目前研究^{[7, 8, 9]}显示:VRAC参与细胞凋亡可能有2种机制,凋亡性体积减小(apoptotic volume decrease,AVD)被认为是凋亡过程中的标志性事件;K⁺和Cl^-经钾通道和VRAC外流是细胞出现AVD的一个重要因素,而AVD是驱动细胞死亡的重要因素,给予VRAC阻断剂能够抑制AVD和细胞凋亡。另外,VRAC能够通过转运HCO₃^-直接降低细胞内的pH值,也能够通过易化Cl^-/ HCO₃^-交换体分泌HCO₃^-间接降低细胞内pH值。细胞内酸化后激活酸性核酸内切酶,进而参与细胞凋亡的过程^[10],因此,抑制VRAC可以阻碍细胞凋亡的进程。研究^[5]显示:阻断VRAC可以明显促进化疗药物的促凋亡作用。某些促进凋亡的中药可以激活VRAC^{[11, 12]}。最近,Park等^[6]将替莫唑胺(temozolomide,TMZ)与NPPB共轭耦联作为新型药物应用于胶质瘤的治疗研究,结果发现:耦联后的药物在抑制胶质瘤的增殖、转移及侵袭的同时,其促进肿瘤细胞凋亡的作用也比单独应用TMZ明显加强。但NPPB促进细胞凋亡的机制尚不清楚。

凋亡的发生是个复杂的过程,包括死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。Bcl-2和Bax作为线粒体途径的重要成员,其表达的变化对细胞的命运起着决定性的作用^{[13, 14, 15, 16]}。Bcl-2和Bax通常以二聚体的形式存在,在凋亡调控上游信号途径中发挥着中心性的作用。当Bax的表达水平高于Bcl-2时,Bax-Bax 同型二聚体占有绝对的优势,诱导细胞凋亡因素增加;Bcl-2表达水平高于Bax时,Bax-Bax二聚体解离,形成更稳定的Bcl-2-Bax二聚体,从而"中和"了Bax诱导凋亡的作用,细胞得以存活。因此,两者的比值决定了凋亡的启动,并在凋亡中起着重要的调节作用。本研究结果显示:NPPB作用后SHG-44细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低,而Bax蛋白表达水平升高,这会导致促凋亡因素增加,使细胞形成更多的Bax-Bax,使下游的Caspase-3活化增加,促进细胞凋亡发生。

综上所述,本研究结果表明:NPPB在一定时间内可以促进肿瘤细胞的凋亡,并且主要是增加了Bax蛋白表达,降低了Bcl-2蛋白表达,最终引起促凋亡因素占优势。NPPB可以通过阻断细胞的容积变化减少细胞凋亡的发生、抑制肿瘤细胞的转移与侵袭,也可促进某些细胞的凋亡或促进某些化疗药物的促凋亡作用,说明NPPB对细胞生长的调节是双向的,其影响细胞的生命周期可能具有一定的时间节点或浓度阈值 ,其对细胞生长的调节还需进行更深入的研究。