尽管近年来采取了综合性肿瘤治疗手段，但恶性肿瘤仍然是严重威胁人类健康和生命的疾病之一，其根本原因是肿瘤的发生发展、转移和复发的机制尚未完全阐明。传统的肿瘤学理论认为：所有的肿瘤细胞均具有无限增殖能力，因此，临床上主要应用手术、放疗和化疗对整个肿瘤病灶进行清除，然而这些治疗方法尚不能根治癌症，特别是对转移病灶的治疗效果更为有限。

近年来通过对肿瘤的分子病理生物学和细胞生物学等的深入研究，提出了肿瘤干细胞理论。该理论认为：肿瘤中存在着少数具有无限自我更新和高致瘤能力的肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)或称为肿瘤启动细胞^[1]。大量研究^{[2, 3]}表明：CSCs是肿瘤的根源，在肿瘤的发生、进展、转移、复发和抵抗常规治疗中起决定性作用。因此，清除CSCs可能达到根治肿瘤的目的，靶向清除CSCs已成为当今癌症治疗的重要策略和最前沿方向^{[4, 5]}。

目前，已从多种肿瘤中分离、鉴定出CSCs，随着研究深入，可能从更多类型肿瘤中分离出CSCs，分离的细胞是否明确为CSCs，必须通过功能性检测和分析加以确认；另外，采用靶向清除措施后能否清除CSCs，清除效果如何，也必须通过CSCs功能性检测来验证和评估^[6]。然而，有时一些清除CSCs措施实施后的检测指标常被忽略，使实验结果不具有确切的说服力。本文结合本研究组的经验和相关文献，总结了近年靶向清除CSCs功能性检测的常用技术，并对这些技术的功能意义和应用中可能出现的问题进行评价，为靶向清除CSCs措施的实施提供参考。

CSCs是指肿瘤组织中存在的一小部分具有干细胞性质的细胞。2006年美国癌症研究协会(AACR)将CSCs定义为：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞^[7]。其中，自我更新(self-renewal) 是指CSCs通过不对称分裂产生一个与亲代CSCs相同特征的子代CSCs的过程^[8]；CSCs产生异质性肿瘤细胞即具有多向分化潜能(multi-lineage differentiation potential)，是指CSCs通过分化形成肿瘤组织中其他各种类型肿瘤细胞的过程^[9]。自我更新和多向分化是CSCs 2个最基本的特征。目前靶向清除CSCs的策略主要有: ① 针对CSCs表面标记物。不同CSCs有不同的细胞表面标志物，常见的有CD133、CD44、CD24、乙醛脱氢酶1(ALDH1)和上皮细胞黏附分子(EpCAM)等。可通过特异性抗体结合CSCs表面标志物杀伤肿瘤干细胞；CSCs表面标志物或其表达的蛋白质与正常干细胞存在差异，针对CSCs表面标志物既可以清除或减少CSCs，又可以保护正常干细胞不被破坏，使其成为靶向治疗的新靶点。已有学者总结了不同CSCs的表面标志物^{[6, 10]}。然而，CSCs表面标志物并非特异，不是所有CSCs均表达标志物，一些非CSCs也可以表达标志物，目前尚无专一的标志物能特异性识别某种CSCs，这使得针对表面标记物的靶向CSCs的策略遇到困难。 ② 调控CSCs的信号通路。 Wnt/β-canetin、Notch、Hedgehog和PI3K/Akt/mTOR等信号通路在CSCs的自我更新和分化潜能中发挥重要作用，调控这些信号途径进行靶向治疗已成为一种重要的手段。目前一些针对Wnt/β-catenin、Notch和Hedgehog信号通路的小分子化合物或选择性抑制剂等正在进行临床前研究和临床试验。 ③ 诱导CSCs分化。 与正常干细胞不同，CSCs往往分化异常或分化受阻，诱导CSCs分化成熟，可能使其失去自我更新和致瘤能力，因此诱导CSCs分化也是一种清除CSCs、抑制CSCs活性的策略。已有研究^[11]证明：骨形态发生蛋白4(BMP4)能促进CD133⁺ 肝癌干细胞分化，并抑制该细胞的自我更新、化疗药耐药和体内致瘤能力。Ying等^[12]研究表明：在恶性脑胶质母细胞瘤治疗中使用全反维A酸可以有效诱导CSCs分化，体内给予全反维A酸后可有效增加 移植肿瘤 小鼠的存活率。 ④ 改变CSCs微环境。 CSCs赖以生存的微环境在其自我更新、多向分化、持续存活和侵袭转移中均发挥重要作用。通过改变CSCs的低氧、邻血管、慢性炎性和上皮间质转化等微环境可以达到清除CSCs的目的^[13]。 ⑤ 靶向干扰与CSCs有关的miRNA。 研究^[14]证明：改变有关miRNA水平可以调控CSCs的分化和自我更新等性能。

虽然可以检查CSCs的耐药、侵袭、迁移、增殖和抵抗凋亡等性能，但CSCs的功能性检测主要围绕其基本特征进行，包括自我更新、致瘤性和分化潜能等，检测方法可分为体外检测和小鼠异种移植试验检测。

克隆形成试验是体外检测CSCs增殖能力和致瘤作用的有效方法^{[15, 16]}。可分为平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验。 ① 平板克隆形成试验。 将体外形成的肿瘤细胞球用消化酶消化为单细胞悬液。台盼蓝染色计数活细胞，以每孔1 000个接种于含10%胎牛血清(FBS)DMEM培养基的6孔板中。37℃、5%CO₂培养箱中培养，每3 d换1次新培养基。培养7~14 d后，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下计数大于60个细胞的克隆个数，计算克隆形成率，克隆形成率＝(形成的克隆数/接种细胞数)× 100% ^[17]。 ②软琼脂克隆形成试验。 软琼脂克隆形成试验通常在塑料培养皿或6孔培养板中进行，由2层琼脂或琼脂糖构成，上层为接种细胞层，琼脂浓度为0.3%~0.4%；下层为铺底层，琼脂浓度为0.5%~1.0%。上层软琼脂可使细胞分散成单个，下层软琼脂作为支撑可防止细胞贴附生长。 将体外形成的肿瘤球用酶消化法分散为单细胞悬液。将琼脂糖与含10%FBS的DMEM培养基混合，分别制备含0.6%琼脂糖的底层琼脂糖培养基和含0.35%琼脂糖的上层琼脂糖培养基。在6孔板铺底层琼脂糖培养基，37°C孵育30 min使之凝固后，将一定量的单细胞悬液加到制备好的上层琼脂糖(预热到40°C)，使细胞与上层琼脂糖充分混匀后，将上层琼脂糖培养基覆盖在底层琼脂糖培养基上。37C、5%CO₂培养箱培养2~3周后，相差显微镜拍照，计数直径大于50 μm的克隆，计算克隆形成率^[18]。接种细胞数可根据实验目的调整。 ③ 药物处理方法。 若检查某种处理因素(药物、化合物等)对克隆形成能力的影响，可先将单细胞悬液用药物处理一段时间(如24或72 h)后，洗去药物后再进行克隆形成试验^{[15, 19, 20]}，也可以每3 d在软琼脂克隆形成试验的上层胶顶部培养基的表面添加药物浓缩液。 ④ 对克隆形成试验的评价。 克隆形成试验是体外检测CSCs增殖状态的方法，一般不用来评价CSCs自我更新能力。克隆形成前细胞的状态、细胞分散程度、接种细胞密度、培养基成分、培养时间和计数方法等均能影响克隆形成试验的结果。

CSCs的特征性性能是在悬浮培养下能形成肿瘤球，肿瘤球形成试验是检测CSCs自我更新能力的重要功能性试验^[7]。该方法采用无血清培养基，加入一定浓度促细胞分裂的生长因子，使绝大多数肿瘤细胞由于缺乏生长所必须的血清成分而停止生长，经长时间培养后最终死亡，而具有干细胞特性的细胞在该培养条件下持续增殖分裂，形成悬浮的球状体。球状体为三维多细胞结构，直径为40 μm或更大，是来自单个CSCs或祖细胞的异质性聚合体，球内富集的干/祖细胞能够增殖并保持未分化状态^[21]。能形成肿瘤球的细胞被称为球形成细胞。不同CSCs形成肿瘤球的难易程度不一。来源于不同CSCs所形成的肿瘤球可有不同名称，如乳腺球、胰腺球、结肠球、神经球和胶质球等。球形成试验使用干细胞培养基，主要成分为：无血清DMEM/F12(1：1)基础培养基，添加人重组表皮细胞生长因子(EGF)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、细胞添加剂B27、N2和抗生素。不同CSCs球形成试验所用培养基的成分不尽相同^[22]。Dontu等^[23]认为：含EGF和(或)bFGF(10×10^-6g·L^-1~20 ×10^-6g·L^-1)、补充胰岛素、氢化可的松和B27的无血清培养基能更好地促进乳腺球形成。Lonardo等^[24]在胰腺癌干细胞球形成试验中证明：补充bFGF、B27和谷氨酰胺的无血清DMEM/F12培养基最适合胰腺癌干细胞生长、扩增和维持。本研究组^[25]在胶质瘤干细胞球形成试验中使用的培养基是补充EGF、bFGF、N2、B27、glutaMAX和肝素的无血清DMEM/F12培养基。

目前主张进行连续肿瘤球形成试验和有限稀释试验。 ① 一代肿瘤球形成试验。 肿瘤细胞系或从患者肿瘤组织分离的肿瘤细胞，采用含10%FBS的DMEM(或RPMI 1640)培养基培养，取对数生长期细胞用胰蛋白酶—EDTA消化后，将一定量细胞转入无血清干细胞培养基、采用超低黏度培养板培养5~7 d。每2~3d换液1次并添加新鲜EGF和bFGF，待悬浮生长的肿瘤球直径大于40 μm时，离心300 g、5 min收集肿瘤球，即为形成的一代肿瘤球。计算球形成效率(sphere-forming efficiency,SFE),SFE=(形成的肿瘤球总数/接种的活细胞数)×100%。一代肿瘤球形成则表明所检测的CSCs可能具有自我更新能力。 ②二代肿瘤球形成试验。 收集一代肿瘤球，采用胰蛋白酶消化分散为单个细胞悬液后，接种于超低黏度96孔板，采用无血清干细胞培养基培养，每2 d补充培养基0.02 mL。7 d后倒置显微镜下计数悬浮生长的二代肿瘤球数^{[24, 26]}。二代肿瘤球的形成则表明所检测的CSCs有较大可能具有自我更新能力。形成二代肿瘤球的数量与一代肿瘤球内球形成细胞的数量有关联，二代肿瘤球的数量则代表了来自一代肿瘤球具有自我更新能力细胞的分裂^[26]。 ③ 三代肿瘤球形成试验。 收集二代肿瘤球，按上述二代球形成试验的方法形成三代肿瘤球，可进一步确证CSCs的自我更新能力，表明所检测的CSCs高度可能具有自我更新能力^[23]。肝癌细胞PLC/PRF/5的三代、六代和九代肿瘤球形成试验证明：将肿瘤球中500个细胞给NOD/SCID小鼠皮下注射即能形成肿瘤，而其亲本细胞则需要2×10⁵个，比球形成细胞的量高400倍。而且随着肿瘤球传代次数的增加肿瘤启动能力并未减少^[17]。研究^[27]证明：卵巢癌SKOV3细胞的球形成可以维持12代以上，表明该球形成细胞在体外具有连续自我更新能力，本文作者应用三代肿瘤球进行其他研究，以确保所用的细胞是CSCs。 ④ 肿瘤球有限稀释试验。 有限稀释试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法，通过分析形成1个肿瘤球所需的最少细胞数，定量测定1个肿瘤细胞群体的肿瘤球形成频率。在研究胶质瘤干细胞的自我更新能力时，Singh等^[28]使用下述方法进行极限稀释试验：第一代肿瘤球形成后，将肿瘤球分散为单细胞悬液，台盼蓝法计数活细胞数，然后接种到含0.2 mL干细胞培养基的 96孔板中，每孔细胞数分别为1、20、40、60、80、100、120直至200，每2 d添加新的培养基0.025 mL，7 d后观察每孔中形成肿瘤球的情况，计算出未形成肿瘤球的孔所占的百分率。以细胞数目为横坐标，未形成肿瘤球的孔所占百分率为纵坐标绘图，计算出回归曲线并求出X轴的截距，即形成1个肿瘤球所需要的最少细胞数，这代表了干细胞的自我更新能力，所需要的细胞数越少表示自我更新能力越强。每孔细胞数可根据实验目的调整。目前有限稀释试验多见于胶质瘤干细胞的研究。在其他CSCs的有限稀释试验中，接种的细胞数需调整。 有些研究者特别注重单个细胞形成肿瘤球的能力。在96孔板每孔只接种1个从胰腺癌球分离的细胞，显微镜下只选含有1个细胞的孔，于接种后第6天和第11天每孔分别加入50 μL无血清培养基，接种14 d后计数每孔中肿瘤球形成数^[29]。 肿瘤球形成后还常采用免疫细胞荧光法、免疫印迹等技术检测肿瘤球细胞中有关干细胞标志物的表达水平，进一步验证肿瘤球细胞的干细胞性质。 ⑤ 药物处理方法。 可采用多种方式检查某种药物或化合物对肿瘤球形成能力的影响：可以在一代肿瘤球形成过程中用药物处理一段时间后，再进行二代和三代肿瘤球形成试验；也可以在二代和(或)三代肿瘤球形成期间进行药物处理。Bao等^[19]的药物处理方法：将收获的一代胰腺球用蛋白酶消化获得单个细胞悬液，按每孔500个细胞接种到超低黏度6孔板，置于肿瘤球形成培养基中，用药物处理一段时间后，收获二代胰腺球并计数。Li等^[30]在乳腺癌干细胞研究中，用机械/酶法将乳腺球分散成单细胞，按一定细胞密度接种到超低黏度6孔板后，用不同浓度萝卜硫素处理，7 d后显微镜下计数形成的乳腺球数。然后在无药物处理情况下再进行二代和三代乳腺球形成试验，分别计数乳腺球数。Lonardo等^[24]只用二甲双胍处理一代肿瘤球，然后传代为二代肿瘤球和三代肿瘤球，发现二代和三代肿瘤球的形成明显减少，表明二甲双胍处理能不可逆地清除大多数CSCs，并对CSCs自我更新有较长时间的影响。有研究者^[31]对一代、二代和三代乳腺球均用药物处理，然后评估药物对乳腺干细胞的清除效果。 ⑥肿瘤球形成试验的评价。 目前已公认每个肿瘤球是由单个CSCs衍生的，肿瘤球形成试验是目前在细胞水平评价单个CSCs自我更新能力最有价值的方法，形成的肿瘤球的数量和大小可用于评估细胞群中CSCs频率。 目前普遍认为：肿瘤球不能完全复制体内肿瘤的三维结构和微环境，肿瘤球细胞与体内真正的CSCs存在很大差别，与CSCs也不存在一对一关系。因此，当使用肿瘤球形成试验研究CSCs时，必须认识到其局限性^{[22, 32, 33]}。 体外检测不能代替体内异种移植模型的检测。一个重要的原则是：肿瘤球形成试验的结果必须经过体内异种移植模型验证^[7]。 应采用低细胞密度接种，高密度接种可能引起细胞聚集，而不是真正的肿瘤球^[34]。 肿瘤球形成试验需在含生长因子、无血清、非黏附和接种克隆密度细胞的条件下进行。肿瘤球形成试验的操作繁琐，效率低，有待改进。应该建立标准化方法，以确保试验的可重复性^[24]。

小鼠异种移植试验是检测CSCs致瘤性的最常用体内试验方法。根据细胞移植试验的次数，可分为一次移植、二次移植和三次移植试验。体内连续异种移植试验是目前公认的检测CSCs的金标准。

分离CSCs，将一定密度的CSCs与PBS或Metrigel混合，注入小鼠皮下或其他部位，每3 d用卡尺测量皮下移植瘤的直径，在一定时间内观察移植瘤的生长情况。

将一次移植形成肿瘤的NOD/SCID小鼠安乐处死，切除肿瘤，酶法及移液管吹打分散细胞，通过40 μm尼龙网获得单细胞悬液，将单细胞体外成球培养后，收集肿瘤球，制备单细胞悬液，再次移植到新的受体鼠体内，观察二次移植肿瘤的形成^[35]。研究者^[36]将一次移植形成的肿瘤按上述方法分散为单细胞悬液，采用流式细胞术分选后，再移植到新受体鼠的体内。

首先应用流式细胞术分选候选细胞；然后将分选的细胞给小鼠皮下或腹腔注射。当二次肿瘤在宿主体内形成后，重复细胞分选和移植步骤。如果产生了三次肿瘤，并且所形成的肿瘤与原始肿瘤的形态特点完全相同，表明三次肿瘤细胞具有完全复制原始肿瘤异质性的潜能，那么所检查的细胞高度可能是CSCs^[37]。Al-Hajj等^[38]发现：给NOD/SCID小鼠接种表达CD44⁺/CD24^-/Low/Lin^-的乳腺癌细胞，成瘤后从瘤组织中分离出表达CD44⁺/CD24^-/Low/Lin^-的细胞，采用100个该细胞再次给小鼠接种，仍可形成肿瘤。按照分离-移植-成瘤的循环，经过4个循环，其形成肿瘤的能力均未下降，表示其具有自我更新能力干细胞的属性，即为乳腺癌干细胞。

检查某种药物或化合物对小鼠移植瘤生长影响的方法很多，如小鼠体内给药处理后观察对一次或二次移植瘤形成的影响；将体内和体外方法组合起来研究药物对CSCs的清除效果等。 ① 小鼠体内给药处理后观察其对移植瘤形成的影响。 本研究组药物处理方法：小鼠皮下注射胶质瘤干细胞，约3周后当皮下移植瘤生长到150~200 mm³时，开始分组并持续药物处理21 d，观察药物对肿瘤体积和动物生存时间的影响^[25]。Gou等^[39]先用药物处理裸小鼠，72 h后将体内形成的肿瘤取出，分散细胞后给另外裸小鼠皮下注射，注射后每3 d测量肿瘤体积。移植肿瘤18或24 d后安乐处死小鼠，观察药物对肿瘤体积的影响。 ② 体外药物处理肿瘤球细胞后再皮下移植肿瘤。 将形成的肿瘤球分散为单细胞，将一定细胞密度的细胞接种在生长培养基上并用药物(TMZ/DAPT)处理。7 d后台盼蓝计数活细胞，裸小鼠皮下注射一定数量的活细胞，注射后监视肿瘤形成，评价药物处理对移植瘤形成的影响^[21]。Hallett等^[40]先用Wnt/β-catenin通路拮抗剂PKF118-310体外处理肿瘤球细胞，然后将这些细胞移植到同系雌性小鼠，观察残余活细胞体内移植后的生长情况，发现PKF118-310体外预处理能以浓度依赖方式减少受体小鼠肿瘤发生率。 ③ 药物对已形成的肿瘤生长的影响。 基本方法：给小鼠皮下注射一定数量的细胞，当肿瘤体积达150 mm³时，小鼠腹腔注射药物(TMZ/DAPT)，观察肿瘤形成情况^[21]。Fu等^[36]将一定数量的人胰腺CSCs与Matrigel等比例混合后注射到NOD/SCID小鼠皮下。注射2周后形成肿瘤，小鼠腹腔注射Gli转录因子抑制剂GANT-61，每周3次，共6周。实验终止时，安乐处死小鼠，分离肿瘤，评价GANT-61对移植肿瘤的影响。 ④ 体内形成肿瘤-体外肿瘤球形成试验。 小鼠皮下注射胶质瘤干细胞形成一次移植瘤，全身给药持续处理10 d后处死小鼠，切除肿瘤，把肿瘤内细胞分散为单细胞悬液，进行体外肿瘤球形成试验，计数形成的肿瘤球数，分析药物对肿瘤内具有自我更新能力的干细胞群丰度的影响^[41]。 ⑤ 体内形成肿瘤-体内再致瘤。 小鼠皮下注射胶质瘤干细胞形成一次移植瘤，持续全身给药10 d后处死小鼠，切除肿瘤，分散肿瘤组织中的细胞，再次移植到小鼠皮下，观察药物对二次移植瘤体积和质量的影响^[41]。

该试验在小鼠体内进行，是利用体内异种移植试验定量评估CSCs致瘤能力的良好方法。从肿瘤球等来源的干细胞获得单细胞悬液，计数活细胞数，将不同稀释密度的细胞分别移植到免疫功能低下小鼠的皮下，每种稀释密度移植5~10只小鼠。移植后一定时间，确定形成肿瘤和未形成肿瘤的动物数，应用极度稀释试验(ELDA)软件估算肿瘤启动细胞频率并进行统计学分析。肿瘤启动细胞频率越高表示细胞的自我更新能力越强。移植到小鼠体内的细胞数和细胞稀释范围可根据实验要求和不同CSCs进行调整。在一项乳腺癌细胞研究^[42]中，应用6种稀释密度(500、200、100、50、25和10个细胞/每个注射点)的细胞接种到受体小鼠腹股沟脂肪垫中，注射后36 d评价肿瘤生长和估算肿瘤启动细胞频率。Lau等^[43]在胃癌GC21细胞研究中，每个皮下注射点的细胞数分别为25 000、10 000、5 000、2 000、1 000、500、100和20个，当肿瘤直径达约1.5 cm时估算肿瘤启动细胞频率。在结肠癌细胞研究中，每个皮下注射点的细胞分别为10 000、1 000、100和10个细胞，移植细胞后120 d终止试验并估算肿瘤启动细胞频率。

一种是正位移植，即将CSCs移植到肿瘤原发的部位，如胰腺癌干细胞移植到胰腺，胶质瘤干细胞移植到脑内。另一种是异位移植，即不考虑肿瘤原发的部位，将CSCs移植到小鼠皮下或腹腔。

用于异种移植试验的动物以往多使用裸小鼠，近年常用NOD/SCID(non-obese diabetes-SCID，NOD/SCID)小鼠。该小鼠具有T、B淋巴细胞联合免疫缺陷、NK细胞活性低下、无循环补体、巨噬细胞和抗原提呈细胞功能损害等特性。最近有研究使用NOD/SCID/白细胞介素2受体γ敲除(NOD/SCID/IL2Rγ^-)小鼠，即NSG小鼠。由于敲除IL-2受体γ链，其免疫功能进一步严重降低，尤其是NK细胞活性几乎丧失，是迄今免疫缺陷程度最高的小鼠，移植CSCs的效果更好。如能使用人源化NOD/SCID/IL2Rγ^-小鼠，效果更为理想。

在免疫功能低下小鼠体内连续移植已被作为CSCs研究的金标准，因为其满足了CSCs定义中2个关键标准，被视为是针对CSCs关键标准最好的功能性试验。从一代受体鼠生成的移植瘤分离出细胞，注射到二代受体鼠仍能生成肿瘤，这是CSCs致瘤能力的最好证明^[7]。但 该方法尚有一定局限性。在恶性度低的肿瘤，肿瘤的生长时间可能超过小鼠的寿命，这对有些药物的筛选是困难的^[44]。因此，发现简易的替代性试验，可以提高药物发现的概率。 微环境常常是种属特异或肿瘤特异的，将人类CSCs移植到小鼠体内，特别是免疫功能明显缺乏的小鼠体内尚不能完全反映CSCs生存的真实微环境，且其可能对移植瘤的生物特性产生一定影响^[44]。 移植细胞的数量和质量、小鼠免疫功能状态、移植部位、肿瘤形成的判定和统计学方法等因素均能对异种移植试验和体内有限稀释移植试验的结果造成影响。

CSCs的多向分化能力是指CSCs通过分化形成肿瘤组织中其他各种类型肿瘤细胞的过程，是CSCs的基本特征之一^[9]。在干细胞培养基中肿瘤球细胞保持着球的形态，很少发生分化，仅有极少或不表达分化标志物。血清和贴壁生长是促进细胞分化的重要因素。分化的CSCs失去干细胞特性，丧失自我更新能力和致瘤性^[41]。检测CSCs分化的方法：收集肿瘤球并置于含10%FBS、不含生长因子的DMEM/F12培养基中培养2周，漂浮的细胞能贴壁并强烈分化，表达分化的标志物^{[22, 35]}，如结肠癌的细胞角蛋白(CK)20、乳腺癌的CK18、CK14和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、卵巢癌的CK7和癌抗原-125 (CA-125)、胰腺癌的CK20和CK19、肝细胞癌的甲胎蛋白(AFP)、清蛋白、CK8、CK18、CK7、CK19、前列腺癌雄激素受体(AR)、前列腺特异性抗原(PSA)和CK18、脑肿瘤的星形胶质细胞标记物胶原纤维酸性蛋白(GFAP)及成熟神经元标记物β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)。可应用免疫细胞荧光法和免疫印迹等方法检测CSCs的分化潜能。可利用肿瘤球形成试验等方法评价分化和未分化细胞的自我更新能力。为确定分化的细胞的自我更新能力，将分化的细胞转移到干细胞培养条件，观察其形成肿瘤球的能力^[45]。为评价未分化细胞的自我更新能力，将分化的细胞重新悬浮在无血清DMEM/F12培养基中，隔日加入新的无血清DMEM/F12培养基，2周后可以再计数肿瘤球数^[46]。

目前CSCs功能性检测仍存在问题，如肿瘤球形成试验操作繁琐、影响因素多和实验室间结果的可比性差。肿瘤球细胞与体内真正的CSCs存在很大差别，肿瘤球并不能完全复制体内肿瘤的三维结构和微环境，因此，肿瘤球形成试验的结果必须经过体内异种移植模型验证。体内连续异种移植试验是检测CSCs的金标准，但移植细胞的数量和质量、小鼠免疫功能状态、移植部位和肿瘤形成的判定等也需规范。目前亟待建立CSCs功能性检测的标准化操作程序，以确保试验的可重复性，同时应该开发研制一些更敏感、更特异、更简便和可定量的检测评价技术^{[7, 34]}。上述介绍的CSCs功能性检测方法均为实验室技术，在临床中如何评价清除CSCs药物的有效性仍然面临不少挑战，研究者们正进行有关探索。目前在临床上对一些CSCs的分离、验证和鉴定尚有一定争议，可能与CSCs所在的肿瘤类型、不同CSCs的起源、特性不完全相同和分离鉴定技术等因素有关联^{[6, 10]}。

针对CSCs的靶向药物具有良好应用前景，代表当今癌症治疗的最前沿方向，研发势头强劲。目前正在实验研究的靶向CSCs药物或化合物有50余种，一些具有这方面作用的药物或化合物不断被发现。另据临床试验网(http://www.clinicaltrials.gov)公布的材料，现已有72项围绕靶向CSCs的临床试验，试验药物包括疫苗、抗体、小分子化合物和用于其他治疗目的的老药等，涉及人体多种癌症。

虽然有多种靶向清除CSCs的策略，但目前的研究主要针对调控CSCs的Wnt/β-canetin、Notch和Hedgehog 3条信号通路。已发现多种小分子化合物能抑制Wnt信号通路。靶向Notch信号通路的主要为γ-分泌酶抑制剂类，有的正在进行临床Ⅰ/Ⅱ期试验。目前已上市的靶向CSCs药物是Hedgehog信号通路小分子抑制剂GDC-0449，又名维莫德吉(Vismodegib)，用于治疗基底细胞癌。临床试验 ^[47] 证明：维莫德吉不仅可以使肿瘤体积缩小，还可以阻止新的基底细胞癌发生。目前最值得期待针对CSCs的药物是波士顿生物技术公司研发的BBI608。BBI608是同类中首个针对高度恶性癌干细胞和其他各种癌细胞的口服小分子药物，通过尚未公开的分子靶向同时抑制多个关键的癌细胞“干性”途径。临床试验^[48]结果显示：BBI608具有极好的安全性、良好的药代谢动力学和强效的广谱抗癌活性，对多种癌症均显示超常的治疗效果，并能抑制肿瘤复发和转移。目前该药正在进行治疗结肠癌和直肠癌的Ⅲ期临床试验。