多种口腔颌面部疾病和牙周病易伴发颌骨缺损，术后需预防性全身使用抗生素。临床中常见因为长期使用抗生素而导致口腔内菌落失衡、造成口腔感染等症状。近年来，通过局部给予消炎药物的方式已经取得了国际上共识，Oringer等^[1]利用米诺环素微球辅助治疗牙周袋探诊深度>5 mm的慢性牙周炎，获得了明显的疗效。林涛等^[2]制备了克林霉素缓释微球并研究其抑菌作用，发现无论是米诺环素、克林霉素还是其他抗菌或抗生素类药物均具有一定药物毒性。中草药野菊花是菊科植物野菊(chrysanthemum indicum)的头状花序，其中野菊花总黄酮(total flavonoids of chrysanthemum indicum，TFC)是野菊花中含量最多、最主要的活性成分,具有广谱抗菌消炎、清热解毒、抗病毒、改善血液循环、抗氧化和清除氧自由基等多种生物活性。研究^{[3, 4]}显示：野菊花及其提取物均无毒性。目前，国内外关于野菊花用于抗炎治疗的研究较少，本研究将TFC制备成缓释微球制剂,既实现了口腔局部组织高浓度持续给药，又降低了术后抗炎治疗带来的副作用。缓释微球所用辅料聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是一种可降解的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性和成膜性，并且其材料降解产物与机体代谢产物相同，因此被广泛应用到医学工程材料领域^[5]。本研究以包封率(entrapment efficiency,EE) 为指标调整初乳的搅拌速度、聚乙烯醇(PVA)浓度和TFC与PLGA的投药比，进行工艺优化，以期制得更安全、消炎效果更好的的药物，在口腔手术治疗中发挥积极作用。

TFC(南京生利得生物科技有限公司)，PLGA、PVA、硝酸铝(分析纯)和芦丁标准品(上海麦克林生化科技有限公司)，二氯甲烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，乙酸乙酯、亚硝酸钠和氢氧化钠均为分析纯(天津市光复科技发展有限公司)，氯化钠(分析纯，天津鼎盛鑫化工有限公司)。光学显微镜(日本Olympus公司)，磁力搅拌器(IKA C-MAG HS7)，扫描电子显微镜(SEM，S-3000N HITACHI)和XB-220A电子分析天平(瑞士Precisa公司),SHZ-88型水浴恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)，LR5-4.2型高速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)，UV-4802H型紫外分光光度仪(美国尤尼柯公司)。

称量0.015 gTFC溶于双蒸水中得到内水相，取0.15 g PLGA溶解于含二氯甲烷与乙酸乙酯各1.5 mL的有机溶剂中作为油相，在磁力搅拌器搅拌下将内水相快速滴加至油相中搅拌形成初乳。精密称量0.5 g PVA 溶于50 mL双蒸水溶液中得外水相，将初乳加入外水相中搅拌形成复乳，加入PVA溶液进行稀释,在磁力搅拌器中以3 000 r·min^-1搅拌4 h除去有机溶剂,于高速离心机5 000 r·min^-1下离心10 min,收集上清液后,取试管部微球洗涤，重复3次，冷冻干燥至质量恒定，得到TFC-PLGA微球粉末。根据初乳的搅拌速度、PVA浓度及TFC与PLGA的投药比，分别设计高、中、低3个比例(初乳搅拌速度分别为2 000、3 000和4 000 r·min^-1，PVA浓度分别为0.5%、1.0%和3.0%，TFC与PLGA的投药比分别为1：5、1：10和1：15)。

①光学显微镜下观察微球大体形态：取少量微球，用蒸馏水分散，置于显微镜下观察微球的外观形态。② SEM观察微球形貌：取少量微球，均匀单层放置于贴有导电胶的金属板上,喷金制成扫描电镜标本,观察外形和大小。 ③绘制微球粒径分布图并计算微球平均粒径：用显微镜测定微球,每次随机选取视野区200个微球，以微球个数作为纵坐标，微球粒径大小(μm)作为横坐标,绘制微球粒径分布图。并通过以下公式计算微球的平均粒径d_av。d_av=(a₁d₁+a₂d₂+a₃d₃+...+a_nd_n)/a₁+a₂+a₃+...+a_n，其中a₁、a₂、a₃ ...a_n代表微球个数,d₁、d₂、d₃ ...d_n代表微球粒径。

称取2.0 ｍg对照品芦丁,加适量甲醇溶解至10 mL混匀，即得含无水芦丁(0.2 g·L^-1) 的 标准溶液。精密吸取标准溶液0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，置于不同量瓶中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL混匀，静置5 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL混匀；静置5 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，用水稀释至刻度混匀；静置15 min，分别制成4、8、16、20、40、60和80 mg·L^-1芦丁标准溶液。从700至200 nm 波长进行扫描，确定最大吸收波长为510 nm。以芦丁标准品吸光度(A)值为纵坐标、浓度(mg·L^-1)为横坐标，于510 nm波长处测A值，进行线性回归求得线性方程为:A=0.0137C+0.0045(r²=0.9975)。

精确量取10 mgTFC样品于50 mL甲醇中完全溶解，取2 mL溶解液于10 mL容量瓶中，按照1.4中方法于510 nm处测定A值，根据回归方程计算TFC样品中TFC含量。精确吸取各组别收集的上清液2 mL于10 mL容量瓶中，按照相同方法计算上清液中TFC含量。通过公式计算载药微球的EE。EE=(样品中TFC含量－上清液中TFC含量)/样品中TFC含量×100%。

在离心管中加入10 mg载药微球粉末，加入PBS缓冲溶液,放入摇床中振荡,温度设为37 ℃,转速为100 r·min^-1,分别在0.5 h、1 h、2 h…12 h、24 h、2 d、3 d…20 d等时间段取出离心管进行离心,抽去上清液,同时补加等量PBS缓冲液,检测样品在510 nm处的A值,通过回归方程计算释药量,以时间为横坐标，累积释药百分率为纵坐标，绘制微球体外释放曲线。

光镜下观察：微球形态规则,分布均匀,粒径大小分布规律(图 1A)。SEM观察：微球为均匀的球形或类球形,表面圆整光滑,大小适中,无黏连(图 1B)。3组优化微球的粒径平均值为(102.20±1.97)μm，集中分布在100~110μm区域，符合正态分布(图 2)，表明微球质量较好。

图 1 光镜(A)和SEM(B)观察TFC-PLGA微球形态表现 Fig.1 Morphology of TFC-PLGA microspheres observed with optical microscope(A)and SEM(B)

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图 2 微球粒径分布图 Fig.2 Diagram of distribution of particle sizes of microspheres

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在一定范围内随着初乳搅拌速度的增加，载药微球的EE呈上升趋势，但在4 000 r·min^-1时EE反而下降。在一定范围内随PVA浓度增大或TFC与PLGA的投药比减小，微球EE均呈上升趋势。见表 1。综合以上3个指标的结果，得到TFC-PLGA微球的优化制备工艺参数为：初乳的搅拌速度为3 000 r·min^-1，PVA浓度为3.0%，TFC与PLGA的投药比为1：15，在该条件下得到的微球EE较高，粒径较为均一。

按照优化条件制备TFC-PLGA微球，重复3次，测得3批微球的EE分别为44.32%、45.21%和45.57%，在该优化工艺条件下,微球的平均EE为(45.03±1.25)%。说明在同一条件下制备的微球重复性好，该优化工艺可行。

体外释放曲线显示：24 h时TFC-PLGA微球体外累积释放率为22.07%，存在“突释效应”。在第20天之前，微球释放率基本稳定，到达20 d后，微球在体外累积释放率达92.32%。见图 3。

图 3 TFC-PLGA微球体外释放曲线 Fig.3 Release curve of TFC/PLGA microspheres in vitro

图选项

临床上口腔疾病导致颌骨缺损的患者在术后需全身应用抗生素预防感染，而为了保持有效的药物浓度，需要经常服药，即使这样经全身循环后到达口腔局部的药物浓度也无法实现长期高效的水平^[6]，并且全身长期使用抗生素将会导致口腔内菌落失衡以及耐药性等毒、副作用^[7]。而局部给药途径能够满足在术区一直维持较高的药物水平，发挥抗炎抗菌的作用^[8]。因此，研制口腔局部应用的消炎药物是目前研究的热点。国内外研究中多以抗生素和抗菌药物制成缓释剂型，并未完全排除药物可能带来的风险。中医中药野菊花在我国大部分地区广泛分布，《中国药典》(2005年版) 称野菊花性味苦辛，微寒，归肝、心经; 具有清热解毒、疏风平肝之功效; 常用于疔疮痈肿，目赤肿痛，头痛眩晕等,在中草药中野菊花流传着“广谱抗生素”之称^[9]。张俊艳^[10]研究显示：TFC(84、168和336 mg·kg^-1，ig) 对大鼠足爪肿胀、大鼠肉芽和佐剂性关节炎均有明显的抑制作用，提示TFC 有明显的抗炎作用。虽然我国野菊花资源非常丰富，但大多数尚未得到合理开发利用，药物剂型较少，因此，将TFC制备成缓释微球作为口腔局部应用的消炎药物不仅拓展了中药给药的新途径，同时也利于中药资源的开发和推广，对中医中药的发展具有重要意义。

微球发挥药物效果主要通过药物被载体包载的有效包载部分。在药剂学中，EE一直是评价载药效果的一个重要衡量指标^[11]。因此，本实验以EE为主要考察指标，对TFC-PLGA 微球进行工艺优化。缓释微球的EE受诸多因素影响，本研究选取对制备过程影响较明显的3个因素：搅拌速度、PVA 浓度和TFC与PLGA的投药比，并观察其对EE的影响。本研究结果显示：①在搅拌速度达到3 000 r·min^-1之前，EE随搅拌速度加快而升高，但当搅拌速度达到4 000 r·min^-1时，EE反而下降，可能由于速度过大而导致微球粒径过小，更多TFC扩散到PVA中，使EE反而下降。过快的速度会使容器不稳定以及溶剂溢出，因此初乳搅拌速度为3 000 r·min^-1更为适宜。 ②一定范围内随着外水相PVA浓度的增大EE随之增大，PVA在3.0%浓度时微球的成球度较好，且粒径较小，分布均匀，与其他文献^[2]中所述结果(即PVA在3.0%浓度下得到微球形状较好)相同，因此最终选用浓度为3.0%的PVA作为外水相。 ③一定范围内，随着TFC与PLGA投药比的下降，EE呈上升趋势。但TFC与PLGA投药比过小时，过多的载体材料会产生很多碎片，影响制备出微球的成球性^{[12, 13]}。因此，药物所占比例不宜太小，以免使制备出的微球药物含量过少从而不能实现药物应有的临床治疗效果。

综上所述，本研究在优化条件下制得了EE较高、粒径适宜的TFC-PLGA微球，且经过重复性实验验证后，证明该微球形态良好，粒径分布均匀，可重复性好，同时在体外实验中该微球表现出良好的缓释性能，但微球抑菌情况及其临床应用的可行性尚需进一步研究。