口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)简称口腔鳞癌，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤。在目前治疗方法中，手术、放疗和化疗仍是主要的治疗手段，虽然手术方式和同期修复水平在近几年有了明显的提高，但中晚期患者的5年生存率仍不理想^[1]。舌鳞状细胞癌 (tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是最常见的口腔癌，约占我国口腔癌发病总数的40%。α-catulin蛋白是一种α-连环蛋白相关蛋白(α-catenin-related protein)，其结构类似于黏着斑蛋白(vinculin)和α-连环蛋白(α-catenin)^[2]。有研究^{[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}显示：α-catulin在卵巢癌、子宫癌、肾癌、黑色素瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌中均呈高表达，其在恶性肿瘤的发生发展、侵袭和转移中发挥重要的调节作用。而 α-catulin与TSCC的关系缺少相关研究。本实验观察沉默α-catulin基因后，人TSCC的TSCCA细胞增殖和凋亡情况，为探讨预防和治疗人TSCC的方法提供依据。

人TSCC的TSCCA细胞购自上海拜力生物公司；质粒由本课题组实验人员设计，江阴雨汐生物有限公司协助合成。Lipofectamin^TM 2000(江阴雨汐生物有限公司)，RT-PCR引物(武汉转导生物科技发展有限公司)，兔抗人α-catulin antibody(美国Thermo公司)，DMEM培养基、链霉素/青霉素、小牛血清、PBS、EDTA消化液、75%酒精、Trypsin液、去核酸酶水、GAPDH、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC，电泳缓冲液、转移缓冲液、SDS-PAGE、硝酸纤维素膜、5%脱脂奶粉、解离液、羊抗兔IgG、彩虹marker、MTT、Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒、PI、RNA酶、1.12%枸橼酸钠溶液 (北京索莱宝科技有限公司)。倒置显微镜(日本Olympus公司)，凝胶图像分析系统和酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

转染前2d，取对数生长期的TSCCA细胞，将细胞按照每孔2×10⁴个细胞铺至6孔培养板中，待细胞铺满90%孔底面积后转染。转染期间先将孔中的有血清培养基换成无血清培养基。分别将0.8 μg α-catulin质粒溶于50 μL Optimen无血清培养基中，2 μL Lipo 2000溶于48 μL Opti-men无血清培养基中，室温静置5 min。再将两者混匀，室温静置20 min后加入24孔板对应板中。6 h后换成有血清培养基，该组为α- catulin-siRNA组。采用同样方法将空质粒转染入TSCCA细胞，设为空质粒转染组。同时设置未转染质粒的TSCCA细胞为空白对照组。

转染后24、48和72 h分别从空白对照组、空质粒转染组和α-catulin -siRNA转染组细胞中提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。以GAPDH为内参，RT-PCR法扩增α-catulin目的基因。α-catulin扩增片段长度为292 bp，上游引物：5′-GAGGCATCCTAACTGCGAATC-3′，下游引物：5′-TCTGTGCTCATGGCTGGTGTA-3′；GAPDH扩增片段长度为452bp，上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。循环参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳中分析结果。目的基因的相对表达水平采用ΔΔCt方法计算。

分别收集转染后24、48和72 h的3组细胞，经预冷的PBS清洗3次，置于冰上经RIPA充分裂解后抽提蛋白并定量。75%SDS-PAGE电泳分离，每孔总蛋白加样量为50 μg，电泳40 V、30 min，90 V、1.5 h，300 mA湿转2 h，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，兔抗人α-catulin (1∶1 000)4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG(1∶5 000)，室温下杂交1 h，PBS洗10次，按化学发光法显影、定影。以GAPDH作为内参。使用Alpha Imager2200图像分析软件分析条带亮度。α-catulin蛋白表达水平＝α-catulin蛋白条带值／GAPDH条带值。

将转染后的3组细胞以每孔1×10⁷个细胞接种于96孔培养板中，每组设6个复孔。分别于转染后24、48和72 h终止培养。每孔加入MTT(5 g·L^-1)10 μL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入DMSD 100 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解，在酶标仪上测各孔490 nm波长处的吸光度(A)值。生长抑制率=(1－实验组A值/对照组A值)×100%。

分别于转染后24、48和72 h收集各组细胞，采用0.25%胰蛋白酶消化，加入冰冷的PBS将细胞轻轻吹打成单个细胞，与漂浮细胞合并；5 000 r·min^-1离心5 min；PBS洗2次，使用约500 μL PBS重悬细胞边振荡边加入5 mL预冷的70%乙醇，4 ℃固定过夜。染色前细胞用PBS洗2次，沉淀重悬于PI染液中(50 mg·L^-1 PI+200 mg·L^-1 RNase A)，37 ℃避光染色30 min。流式细胞仪上机检测。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。各组TSCCA细胞中α-catulinmRNA和蛋白的相对表达水平、细胞生长抑制率及凋亡率均以x±s表示，组间比较采用t检验。以α=0.05为检验水准。

各组TSCCA细胞转染后继续培养24 h，α-catulin-siRNA转染组细胞中α-catulin mRNA相对表达水平明显低于空质粒转染组和空白对照组(P < 0.01)，空质粒转染组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。同时，随着培养时间的延长，α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞中α-catulin mRNA的相对表达水平逐渐降低，以72 h时表达水平最低，低于24和48h时的表达水平 (P < 0.01)； 各时间点(24、48和72 h)α-catulin mRNA相对表达水平比较差异均有统计学意义(P < 0.01) 。见图 1和表 1。

Lane 1: Blank control group; Lane 2: Empty plasmid transfection group; Lane 3-5: α-catulin-siRNA transfection group(24, 48, and 72 h). 图 1 RT-PCR法检测各组TSCCA细胞中α-catulin mRNA表达电泳图 Fig.1 Electrophoregram of expressions of α-catulin mRNA in TSCCA cells in various groups detected by RT-PCR method

图选项

Western blotting检测结果:与空白对照组比较，空质粒转染组TSCCA细胞中α-catulin蛋白相对表达水平差异无统计学意义TSCCA(P>0.05)，而α-catulin siRNA转染组TSCCA细胞中α-catulin蛋白的相对表达水平明显降低。Alpha Imager 2200图像分析软件分析条带亮度示：转染后24、48和72 h时，α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞中α-catulin蛋白的相对表达水平(0.32±0.62、0.28±0.71、0.19±0.58)均低于空白对照组(0.69±0.61)和空质粒转染组(0.69±0.61)(P < 0.05)。见图 2。

M: Protein marker; Lane 1: Blank control group; Lane 2: Empty plasmid transfection group; Lane 3-5: α-catulin-siRNA transfection group (24, 48, and 72 h). 图 2 各组TSCCA细胞中α-catulin蛋白表达电泳图 Fig.2 Electrophoregram of expressions of α-catulin protein in TSCCA cells in various groups

图选项

MTT法检测各组TSCCA细胞A值结果：α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞的生长曲线低平(图 3)，24、48和72 h生长抑制率分别为(35.231±1.143)%、(35.924±1.035)%和(36.417±0.967)%，均高于各检验时间点空质粒转染组[(9.776±0.936)%，t=46.031，P < 0.001；(10.357±0.977)%，t=48.606，P < 0.001；(11.087±1.254)%，t=39.765，P < 0.001]和空白对照组[(8.315±0.829)%，t=51.961，P < 0.001；(9.987±1.036)%，t=45.744，P < 0.001；(12.372±0.984)%，t=44.777，P < 0.001]。

A: Blank control group; B: Empty plasmid transfection group; C：α-catulin-siRNA transfection group. 图 3 各组TSCCA细胞的生长曲线 Fig.3 Growth curves of TSCCA cells in various groups

图选项

利用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色检测TSCCA细胞凋亡情况。转染后48 h时，α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞中出现大量早期凋亡细胞，而空白对照组和空质粒转染组中少见凋亡细胞。

Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色后采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。α-catulin-siRNA转染组TSCCA细胞凋亡率峰值达到(18.014±1.030)%，高于空质粒转染组[(9.297±0.742)%,t=16.974,P < 0.001]和空白对照组[(9.323±1.247)%,t=21.738,P < 0.001]。见图 4。

A: Blank control group; B：Empty plasmid transfection group; C: α-catulin-siRNA transfection group. 图 4 各组TSCCA细胞培养48 h时细胞凋亡情况 Fig.4 Apoptosis situation of TSCCA cells after cultured for 48 hin various groups

图选项

OSCC是严重危害人类健康的疾病，约占全身恶性肿瘤的3%^[10]，其中超过90%为鳞状细胞癌^[11]。由于OSCC的治疗和预防在很多方面仍然处于探索阶段，所以目前OSCC尽管通过手术、放疗和化疗等方法治疗，但均难以彻底根治^[13]。近年来OSCC发病年龄呈年轻化态势，尤其当临床中发生TSCC时，其诊断与治疗则变得更加棘手^[12]。TSCC的发病率呈上升趋势。TSCC作为最常见的口腔恶性肿瘤，具有转移率高、易复发和预后差等特点。深入研究TSCC发生发展机制、揭示其生物学特性，对判断其恶性程度、指导临床治疗和评估预后具有重要意义。

Janssens等^[14]克隆了一种新的人cDNA，基于其与α-catenin和vinculin序列具有相似性，将其命名为α-catulin。α-catulin是CTNNAL1编码的膜转运蛋白，其过表达可降低E-cadherin并增加N-cadherin、Snail/Slug和MMPs的表达，进而促进黑色素瘤的侵袭和转移^[5]。 α-catulin 蛋白的结构表明其在细胞中起到连接细胞骨架的作用，具有维持细胞形态、细胞运动和黏附、细胞骨架重塑及细胞信号传导的调节等作用。细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。α-catulin能调节核因子κB(NF-κB)通路进而有致癌潜能^[14]。研究^{[15, 16]}显示：α-catulin能够击倒改变细胞周期调控中的几个关键基因，这些关键基因所诱导的细胞衰老可能是由染色体故障造成的，从而引起严重的DNA损伤并抑制受损DNA的修复能力，表明α-catulin通过抑制肿瘤细胞衰老而促进肿瘤生长。

本课题组将α-catulin-siRNA基因通过质粒转染入人TSCC的TSCCA细胞中，观察沉默α-catulin对TSCCA细胞生长的影响。采用RT-PCR法检测各组TSCCA细胞中α-catulin基因的沉默情况，证明α-catulin-siRNA对TSCCA中α-catulin基因沉默效果极佳；MTT实验结果显示：沉默α-catulin后，TSCCA细胞的增殖能力明显降低；流式细胞术结果证明沉默α-catulin基因后TSCCA的细胞凋亡率明显升高。

综上所述，靶向α-catulin RNA干扰质粒能有效抑制人TSCC的TSCCA细胞中α-catulin表达水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进TSCCA细胞的凋亡，显现了高效的抑瘤效应。因此，α-catulin有望成为治疗TSCC的新靶点，而其相关机制的进一步深入研究将为TSCC的基因治疗带来新的希望，并建立新的肿瘤治疗模式。