口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是世界上常见的恶性肿瘤，占口腔癌总数的90%以上^[1]，其中舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)为最常见的OSCC。目前TSCC的治疗多采用以手术治疗为主、术后辅以放化疗的综合治疗方法，但效果并不理想，预后较差，研究^{[2, 3]}表明：TSCC患者术后5年存活率 < 60%。因此，TSCC的基因治疗成为了近些年来研究的热点。α-catulin蛋白是一种α-连环蛋白相关蛋白(α-catenin-related protein)，因其结构类似于黏着斑蛋白(vinculin)和α -连环蛋白(α-catenin)而得名。α-catulin蛋白具有调节信号通路传导、重塑细胞骨架、参与细胞运动及黏附等作用^{[4, 5]}。目前有研究^{[6, 7]}显示：α-catulin蛋白在恶性肿瘤中呈高表达，并且通过调节核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB )、小G蛋白(Rho)等信号通路与肿瘤细胞的侵袭及凋亡有密切关联。目前，有关α-catulin基因与TSCC的研究尚不多，对其作用机制的研究更少见。本研究通过RNA干扰(RNAi)技术构建α-catulin-shRNA表达载体，并将其转染至体外培养的人TSCC的TSCCA细胞中，为探讨α-catulin基因的功能及其在TSCC发生发展中的作用机制提供一个全新的细胞模型，也为TSCC的基因治疗提供实验依据。

人TSCC的TSCCA细胞(上海拜力生物公司)，转化用大肠杆菌感受态细胞DH5 a(北京Tiangen Biotech公司)。DMEM/F12培养基、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，琼脂糖、琼脂粉和胰蛋白胨、酵母提取物(英国OXOID公司)，用于插入shRNA的载体质粒pGPU6/GFP/Neo及阴性对照质粒(北京Biovector Co.,LTD公司)，限制性内切酶BbsⅠ和BamHⅠ、T4 DNA连接酶以及RT-PCR试剂盒(日本Takara公司)，RNA提取试剂Trizol、质粒提取试剂盒以及Lipofectamine^TM2000(美国Invitrogen公司)，兔抗人α-catulin抗体(美国Thermo公司)，全蛋白提取试剂盒(中国凯基生物公司)。二氧化碳恒温细胞培养箱(美国Forma Scientific 公司)，荧光显微镜(上海光学仪器厂)，荧光定量PCR仪、台式高速离心机和凝胶成像仪(北京六一实验仪器厂)。

根据GenBank数据库提供的α-catulin(CTNNAL1)基因的核苷酸序列(NM_003798)，按照Tuschl的设计原则^[8]，选择4个靶点设计4条靶向序列，分别命名为sh-catu1、sh-catu2、sh-catu3和sh-catu4(靶向序列见表 1)。含无义序列shRNA的阴性对照质粒命名为sh-nc。

2条互补的单链寡核苷酸片段各取10μL，加入10μL的退火缓冲液及20μLddH₂O，制成混合液；按照95 ℃、2 min，然后每90 s下降1℃，降至25℃的程序退火，获得双链DNA片段。在T4连接酶的作用下，双链DNA片段与经BbsⅠ和BamHⅠ双酶切的pGPU6/GFP/Neo载体质粒相连。连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，种板后37℃培养过夜。随机挑取单克隆阳性菌落接种于含氨苄青霉素(终浓度为50 mg·L^-1)抗性的LB平板上，37℃恒温摇床(180 r·min^-1)培养12～16 h。按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，送江阴雨汐生物科技有限公司进行测序鉴定。

TSCCA细胞用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基于37℃、5%CO₂的孵箱中培养。取处于对数生长期的TSCCA细胞，以每孔5×10⁵接种于6孔板内，当细胞达到70%～80%融合时进行转染。转染前6 h换成无血清无抗生素的培养基，转染按照Lipofectamine^TM2000说明书进行。将细胞分为转染组(转染α-catulin-shRNA重组质粒)、阴性对照组(转染sh-nc重组质粒)及空白对照组(未处理)。转染后各组质粒置于37℃、5%CO₂条件下培养4～5 h，换成含血清培养基继续培养。转染后48 h在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的表达情况，流式细胞分选术(FACS)测定转染效率，转染效率=GFP阳性细胞数/筛选细胞总数×100%。

细胞转染后48 h用Trizol试剂提取细胞总RNA，并按照RT-PCR试剂盒说明书将其逆转录成cDNA。取1 μL模板cDNA，按试剂盒说明书配制反应体系,置于RT-PCR反应仪中：95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min，共40个循环。α-catulin基因引物：上游引物F，5′- CATTGGAAGTCATCTTGGAGC -3′；下游引物R,5′- GCTGTGTCGCTGTACTATGA -3′。内参GAPDH引物：上游引物F,5′- CCACTAGGCGCTCACTGTTC -3′；下游引物R,5′- AGGCGCCCAATACGACCAA -3′。引物的合成由江阴雨汐生物科技有限公司完成。2%凝胶电泳观察扩增结果。α-catulin mRNA相对表达水平用2^-△△CT表示^[9]。α-catulin mRNA的沉默效率＝1－(各转染组相对表达水平/空白对照组相对表达水平)×100%。

按全蛋白提取试剂盒配制细胞裂解缓冲液，提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度。以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转至硝酸纤维膜(PVDF)上，5%脱脂奶封闭1 h，洗膜，加入兔抗人α-catulin单克隆抗体(稀释浓度1：500)，4℃过夜。洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，温室作用1 h。然后加入ECL显示液，反应3 min，入暗室曝光45 s，显影定影后扫描分析。采用Image-Pro Plus图像分析软件分析灰度值，各组蛋白条带灰度值均以对应的内参照β-action为基准进行校正，计算相对灰度值。α-catulin蛋白的沉默效率=1－(各转染组相对灰度值/空白对照组相对灰度值)×100%。

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。α-catulin基因的mRNA和蛋白相对表达水平及沉默效率以x±s表示，mRNA和蛋白相对表达水平组间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验；沉默效率组间比较采用χ² 检验。以α=0.05为检验水准。

测序结果：重组质粒中插入的目的序列与设计的α-catulin-shRNA序列完全一致，未发现碱基错配及突变，说明成功构建了表达α-catulin shRNA的真核表达载体。见图 1(插页二)。

图 1 重组质粒的测序结果 Fig.1 Sequencing results of recombinant plasmid

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荧光显微镜下观察转染48 h后的TSCCA细胞，荧光主要集中于细胞质中(图 2，见插页二)，表明GFP在细胞中成功表达。FACS检测结果显示各组转染效率均在55%以上。

图 2 重组质粒sh-catu2转染后TSCCA细胞中GFP的表达(×100) Fig.2 Expression of GFP in TSCCA cells after transfected with sh-catu2(×100)

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mRNA和蛋白的相对表达水平和沉默效应RT-PCR检测结果：与阴性对照组及空白对照组比较，转染组TSCCA细胞中α-catulin mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)，见图 3。与空白对照组比较，阴性对照组细胞中α-catulin mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。 各转染组TSCCA细胞中 α-catulin mRNA的 沉默效率分别为(43.20±1.32)%、(77.00±1.78)%、(62.70±1.53)%和(72.50±1.69)%，均高于空白对照组(0%)和阴性对照组 (5.00%±0.25%) (P < 0.05) (表 2)。Western blotting检测结果：转染组各条带明显变细(图 4)。与空白对照组比较，阴性对照组TSCCA细胞中α-catulin蛋白的相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。转染组TSCCA细胞中α-catulin 蛋白相对表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)。 各转染组细胞沉默效率分别为(45.60±1.41)%、(58.20±1.63)%、(48.40±1.73)%和(49.30±1.57)%，均高于空白对照组(0%)和阴性对照组(1.50%±0.38%) (P < 0.05) (表 2)。其中靶向sh-catu2对α-catulin基因的沉默效应最高。

C:Blank control group;NC:Negative control group;1-4:Transfection groups(transfected with sh-catu1,sh-catu2,sh-catu3， and sh-catu4,respectively). * P < 0.05 vs blank control group; △P < 0.05 vs negative control group. 图 3 RT-PCR法检测各组TSCCA细胞中α-catulin mRNA的相对表达水平 Fig.3 Relative expression levels of α-catulin mRNA in TSCCA cells in various groups detected by RT-PCR method

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Lane 1:Control group;Lane 2:Negative control group;Lane 3-6:Treatment group(TSCCA cells transfected with sh-catu1,sh-catu2,sh-catu3,and sh-catu4,respectively). 图 4 Western blotting法检测各组TSCCA细胞中α-catulin 蛋白相对表达的电泳图 Fig.4 Electrophoregram of relative expression of α-catulin protein in TSCCA cells in various groups detected by Western blotting method

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由于TSCC具有快速局部侵润、早期颈部淋巴结转移和高复发率等特点，所以TSCC比其他头颈部鳞癌(HNSCC)更具危险性。近些年来，虽然手术及放化疗的疗效不断提高，但患者预后仍较差^[10]。因此基因的靶向治疗已经成为了肿瘤治疗的一种新途径。肿瘤的发生是基于基因水平的癌基因的过度激活和(或)抑癌基因的失活或突变，所以，可利用RNA干扰(RNAi)技术沉默过度激活的癌基因，恢复细胞的正常生长表型，从而达到抑制肿瘤发生发展的目的。

α-catulin是一种新发现的癌基因，其促进肿瘤发生发展的作用机制尚不完全清楚。目前研究者^[11]认为：敲除癌细胞中的α-catulin基因可激活野生型或突变型p53，从而触发DNA损伤反应，最终诱发体外细胞的衰老及抑制肿瘤的形成。α-catulin下调上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，通过上皮-间质转化(EMT)在恶性肿瘤的侵袭及转移过程中起到重要作用。此外，高表达的 α-catulin可使基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达水平升高，激活Rho /Rock，从而促进肿瘤的侵袭转移^[12]。淋巴增强因子1(lymphoid enhancer factor-1,LEF-1)与细胞生长、变异及凋亡有密切关联。LEF-1能够调控CTNNAL1的表达，表明 CTNNAL1可能在细胞生长及创口愈合中起重要作用 ^[13]。

RNAi是小片段RNA 分子在mRNA 水平上阻断相应基因表达的过程，即序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)过程。RNAi技术目前已广泛用于基因功能及信号传导通路的研究，为肿瘤的基因治疗提供了实验基础。目前，实现RNAi较常用的是化学合成siRNA法及shRNA表达载体法。化学合成siRNA法简单但干扰效果持续时间短，shRNA表达载体法操作较难但干扰效果较siRNA法持久。研究^{[14, 15]}表明：与腺病毒、腺相关病毒等其他表达载体比较，慢病毒介导的RNAi载体能够实现对靶基因的长期而稳定的沉默。但慢病毒表达载体具有实验周期长及对实验人员要求高等特点。因此，本研究选择α-catulin-shRNA 质粒表达载体来建立沉默的细胞模型。

目前，a-catulin基因与OSCC关系的研究尚少见。研究者^{[16, 17]}发现：在TSCC组织中，随着α-catulin蛋白阳性表达率增高，E-cadherin蛋白阳性表达率明显下降，二者呈负相关关系。

本实验成功构建了沉默α-catulin的TSCCA细胞模型，为后续的α-catulin基因功能研究提供了一个全新可操作的细胞模型，有助于揭示α-catulin基因在TSCC发生发展过程中的作用，进一步阐明TSCC的发病机制，同时为TSCC的基因治疗开拓了一个新的潜在靶点。