动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种严重威胁人类健康的进行性疾病，其发生发展涉及多种因素，其中炎症反应与AS有关联，而巨噬细胞也起关键作用^[1]。干扰素调节因子5(interferon regulatory factor 5，IRF5)作为干扰素调节因子家族(IRF)的一员，以其活化Toll样受体介导的先天性免疫反应而为人所知。近年来研究^{[2, 3]}显示:IRF5基因对巨噬细胞的极化起重要作用，进而加速AS的进程，是目前心血管病领域新兴的研究热点。

干扰素(interferon,IFN)是一类能够抵抗病毒感染、抑制细胞周期并行使免疫调节功能的细胞因子。IRF是一类结构特征保守且功能丰富的转录因子家族，其成员能够在病毒感染时与IFN启动子结合，在诱导、调节干扰素转录、先天性免疫和适应性免疫调控、Th细胞分化等方面均有重要作用^[4]。IRF广泛表达于各类细胞中，目前为止，已经发现了9种哺乳动物来源的IRF(IRF1～IRF9)及多个病毒来源的IRF(v-IRF)，但对IRF家族成员中IRF5基因功能的研究尚处于起步阶段，其在AS局部微环境下对巨噬细胞极化及功能的研究尚未见报道。研究^{[5, 6]}显示:IRF5可以调节Ⅰ型IFN的产生，通过TLR-9通路激活IFN下游靶基因，参与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生，且IRF5是一种肿瘤抑制因子，能够通过阻滞细胞周期抑制细胞凋亡和激发免疫活性；同时，活化的IRF5能够激活胱天蛋白酶级联反应，促进DNA断裂和细胞凋亡^{[7, 8]}。

2011年Krausgruber等^[9]研究显示：IRF5在炎症的发生发展中发挥双重调控作用——既能够促炎症反应也能够抑制炎症反应：阻断巨噬细胞生成IRF5可以抑制机体免疫反应，可用于治疗多种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮以及多发性硬化症等；反之，提高巨噬细胞中IRF5蛋白水平有利于治疗免疫系统受损的患者。研究者^[9]进一步提出IRF5是巨噬细胞功能的关键分子开关，对巨噬细胞的基因表达谱起决定作用。

本研究通过构建携带IRF5基因的重组慢病毒载体，感染巨噬细胞RAW264.7，使IRF5基因在RAW264.7细胞中得到稳定表达，为探讨IRF5基因在AS发生发展中的作用机制提供可靠的细胞模型和实验基础。

小鼠巨噬细胞RAW264.7、293FT包装细胞和DH5α感受态细胞均由本课题组保存。cDNA表达载体LV11(美国Promega公司)，Lipofectamine^TM2000、Opti-MEM培养基(美国Invitrogen公司)，EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ内切酶、Taq酶和DNA相对分子质量标准(美国TaKaRa公司)，IRF5单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒及其他常规化学试剂(北京鼎国生物有限公司)。PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)，电热恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)，电泳仪电泳槽(上海Tanon公司)，PowerPac TMHC电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

根据NCBI IRF5基因序列(NCBI登录号为NM_001098629.2)全长设计并合成引物： IRF5-F，5′-GATTGGAATTCGCC-A CCATGAACCAGTCCATCCCAGTGGCTC-3′；IRF5-R，5′-CTAGAGGGATCCTTATTGCATGCCAGCTGGGTGCATAGG-3′，在上下游引物5′端分别加上限制性内酶切酶(EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ)位点和保护碱基，该部分工作由广州复能基因有限公司完成。

以基因库存中的质粒cDNA为模板，进行PCR反应。反应完成后利用Agarose电泳并切胶回收IRF5基因片段，采用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ分别对IRF5基因片段及载体LV11进行双酶切，回收酶切产物，采用T4 DNA ligase连接双酶切得到的IRF5基因片段和线性化的载体，22℃连接2 h。连接后命名为LV11-cmv-neo-IRF5。重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，次日随机挑取转化生长的阳性克隆菌落，分别摇菌过夜，采用PCR和双酶切法对重组表达载体进行鉴定，同时取阳性克隆送华大基因公司测序。

通过脂质体Lipofectamine^TM 2000介导将慢病毒表达载体与辅助质粒共转染293FT包装细胞，培养48 h后收集病毒上清液。转染前1天将RAW264.7细胞接种至24孔板中，待培养细胞达到80%～85%汇合时去除孔内培养基，将含5 g·L^-1聚凝胺的病毒上清稀释培养基加入细胞培养孔中，感染完毕后换为1 mL完全培养基过夜；筛选G418细胞最小致死浓度，以1 g·L^-1浓度的G418抗性筛选获得RAW264.7-NC和RAW264.7-IRF5稳定株细胞，后期以低浓度G418维持筛选后的稳转株。

维持抗性浓度的G418培养液扩增稳定感染的RAW264.7-NC(对照组)和RAW264.7-IRF5细胞(实验组)，以每孔5×10⁵接种于6孔板，24 h后收集细胞提取总RNA及总蛋白质。

每孔加入1 mL Trizol提取2组细胞总RNA，采用核酸分光光度法定量并测定其纯度，采用MMLV-RT逆转录酶合成cDNA，采用普通PCR反应进行条件探索及优化，SYBR Premix Ex Taq Kit进行qPCR检测细胞中IRF5 mRNA表达水平。以GADPH作为内参，所需引物序列如下：IRF5-F，5′-TATGCCATCCGCCTGTGT-3′；IRF5-R，5′-TCCCCAAAGCAGAAGAAGAT- 3′，扩增产物片段长度为200 bp；GAPDH-F，5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；GAPDH-R，5′ -TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA- 3′，扩增产物片段长度为123 bp。

计算目的基因mRNA相对拷贝数，即IRF5基因与内参基因的表达差异倍数和实验组与对照组细胞中IRF5 mRNA的表达差异倍数。

收集RAW264.7-NC和RAW264.7-IRF5细胞，用1 mL预冷PBS洗涤2次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min。枪头吹打以充分裂解细胞后提取总蛋白，经BCA法检测蛋白浓度后行10％SDS-PAGE电泳，分离后电转移至PVDF膜上，将PVDF膜浸入5%脱脂奶粉/TBST，室温摇床缓慢摇动，封闭60 min，IRF5一抗4℃孵育过夜(1∶2 000稀释)、GADPH二抗37℃孵育1 h(1∶5 000稀释)，用ECL底物进行化学发光，在暗室中经压片、显影、定影。结果用凝胶成像分析系统拍照，采用条带灰度分析软件ImageJ分析2组细胞中IRF5蛋白的表达水平，以目标蛋白条带与内参条带灰度的比值表示。

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。RAW264.7-NC和RAW264.7-IRF5细胞中IRF5 mRNA表达水平以x± s 表示，组间样本均数比较采用t检验。以α=0.05为检验水准。

目的基因片段经扩增和双酶切后，1%琼脂糖电泳结果：在约1595 bp处有明显的目的条带(图 1A)，大小与理论一致，表明IRF5正确插入LV11载体中。将阳性克隆进行测序分析，将测序结果与GenBank中登录的IRF5基因(NCBI，NM_001098629.2)标准序列进行比对，所获得的扩增序列完全正确(图 1B)。

A：Recombinant plasmid identified by EcoR Ⅰ and BamH(Lane 1: LV11-cmv-neo-IRF5；Lane 2-3: Marker fermentas SM0331)；B：Sequences of positive clones identified by enzyme digestion. 图 1 LV11-cmv-neo-IRF5慢病毒表达载体的构建和鉴定 Fig. 1 Construction and identification of LV11-cmv-neo-IRF5 lentiviral expression vector

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与对照组细胞(1.00±0.00)比较，实验组细胞中IRF5 mRNA表达水平(40299.16±7518.69)升高(P＜0.001)。

2组细胞中IRF5蛋白相对分子质量为55000，经条带灰度分析软件测量：实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。见图 2。

A:Electrophoregram;B:Histogram. 图 2 Western blotting法检测2组细胞中IRF5 蛋白表达水平 Fig. 2 Expression levels of IRF5 protein in cells in two groups detected by Western blotting method

图选项

AS是一种由多因素造成的在多年内不断进展的终生性疾病，其因素各自作用于不同的环节，包括性别、年龄、吸烟、高血压、糖尿病、肥胖、高胆固醇血症和高甘油三酯血症为主的血脂异常以及家族遗传等^[1]。目前，AS是一种特殊的慢性炎症疾病的观点已被普遍认可，巨噬细胞作为第一个被认为与AS有关联的炎症细胞，最新的研究^[9]显示：其具有可塑性，即表现不同的极性(M1型与M2型)，并且两者之间可相互转化。目前倾向于认为:M1型(经典极化型)为促炎类型，可分泌促炎细胞因子，能够加重AS的炎症反应，并增加机体对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的摄取及沉积，加快动脉粥样斑块的形成，同时也会对粥样斑块的纤维帽进行破坏，弱化纤维帽的稳定性，而增加斑块破裂形成血栓的风险；与之相反，M2型(选择性极化型)为抗炎类型，能抑制促炎细胞因子的生成，具有组织修复功能，能够促进斑块纤维帽形成，进而稳定斑块，减少斑块破裂出血的风险^[10]。因此2种亚型巨噬细胞的形成及平衡与AS的进展有关联。研究^[11]显示：斑块中存在不同亚型的巨噬细胞，M2型(CD68⁺/CD206⁺)巨噬细胞分布于远离脂核的斑块肩部以及斑块周边，而M1型(CD68⁺/CCL2⁺)巨噬细胞恰好相反，主要分布于AS斑块的脂质核心区。

IRF5作为IRF的一员能够介导抗病毒反应，能够引起IFN依赖性基因以及细胞凋亡基因的表达，并同时能对IFNα/β的产物进行调节^[12]。同时IRF5是一种转录因子，能够与目标基因的调节区相结合并调整该基因的表达，并能够激活Ⅰ型IFN、炎症细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素6(IL-6)、一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素23(IL-23)等]以及肿瘤抑制因子等基因的编码。人体IRF5基因多态性会导致自身免疫抗体及促炎症细胞因子分泌异常，IRF5基因的多态性与系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化以及炎症性结肠病等自身免疫性疾病的发病有关联。IRF基因多态性也是急性冠脉综合征重要因素，且IRF5 mRNA可在人AS组织中表达^[13]。研究^[9]显示：IRF5可对促进炎症反应基因和抑制炎症反应基因发挥双重调控作用。研究者进一步提出IRF5是巨噬细胞功能的关键分子开关，对巨噬细胞的基因表达谱起决定作用。但该研究小组还无法确定IRF5是通过直接影响DNA还是与其他相关蛋白互相作用而实现对各类基因的调控的。IRF5基因敲除的小鼠对于LPS诱导的内毒素休克耐受^[9]，而IRF5缺失的巨噬细胞M1分子标志物的表达水平明显降低^[14]。研究^{[15, 16]}显示：IRF5能够使巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，加快AS进程。本研究旨在构建重组慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7，观察其转染效率及其在RAW264.7细胞中的表达。采用PCR、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切技术成功构建重组慢病毒质粒LV11-cmv-neo-IRF5，病毒上清液可高效感染RAW264.7细胞并筛选G418细胞最小致死浓度，最终以1 g·L^-1G418抗性筛选获得RAW264.7-NC和RAW264.7-IRF5稳定株细胞，后期以低浓度的G418维持筛选后的稳转株。提取细胞总RNA后行RT-qPCR检测细胞中IRF5 mRNA表达水平结果显示：与对照组比较，实验组细胞中IRF5 mRNA表达水平升高。收集RAW264.7-NC和RAW264.7-IRF5细胞裂解液作为样本，以Western blotting法检测IRF5蛋白表达结果显示：IRF5蛋白相对分子质量为55000，实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。

本研究成功构建了携带IRF5基因的慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5，并利用慢病毒感染技术成功获得了稳定表达IRF5的巨噬细胞株RAW264.7-IRF5，为IRF5对AS局部巨噬细胞极化的调节及其机制的研究奠定了基础，为从分子水平探讨AS的发生发展机制提供了理想的细胞模型。