人参为名贵中药材，具有补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目开心益智的作用。现代研究表明人参含有多种皂苷类、多糖、糖肽和挥发油等成分。国内外研究^{[1, 2, 3, 4, 5, 6]}显示:人参中的皂苷成分是发挥人参功效的主要成分之一，具有增强学习和记忆能力的功能及改善认知功能的作用。近年来研究显示：人参水提物也具有改善记忆的生物活性。胡胜全等^[7]报道：人参水提取物对于Aβ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡有神经保护作用。Hiroaki等^[8]报道：通过口服红参的非皂苷部分可以提高老龄大鼠的学习和记忆能力等。王盛民等^[9]报道：人参及膨化制品人参水提物对记忆获得、记忆巩固和记忆再现障碍均具有明显的改善作用。但至今对人参水提物增强学习记忆作用的活性物质研究尚未见报道。本研究对人参水提物中改善记忆的活性物质进行筛选，经分离纯化、灌胃给药后，其能明显改善小鼠记忆获得障碍和小鼠记忆巩固障碍。理化性质研究结果表明：具有增强学习记忆的人参水提物中的活性物质为人参糖蛋白组分。本研究旨在为人参的有效利用和开发提供依据。

葡萄糖、葡聚糖标准品购自美国Sigma公司，氢溴酸东莨菪碱注射液购于天津药业集团新郑股份有限公司，其他试剂为国产分析纯。754紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司产品)，高效液相色谱系统、10AT-VP泵和示差折光检测器(日本岛津公司)，GPC软件(北京龙智达软件有限公司)，DT-200小鼠跳台测试仪(杭州雷琪实验器材有限公司产品)，Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司产品)。

取干燥的人参根2 kg，粉碎，加6 L 80%乙醇浸泡过夜，加热回流，重复2次，每次2 h。经乙醇回流后的人参渣挥去乙醇，加6 L水浸泡2 h，煎煮2次，每次2 h。煎煮液过滤，合并滤液，浓缩至适当体积，超滤(截留相对分子质量10 000)，取分离液，浓缩，冻干，获得人参非皂苷部分。

采用苯酚-浓硫酸法，以葡萄糖为标准品测定总糖的质量分数^[10]；采用间-羟基联苯法，以半乳糖醛酸为标准品测定酸性糖的质量分数^[11]；采用Lowry法，以牛血清蛋白为标准品测定蛋白的质量分数^[12]。

采用高效液相色谱法(HPLC)，以葡萄糖和相对分子质量为1 000、3 000、5 000、12 000和25 000的葡聚糖标准品绘制标准曲线，根据样品在相同色谱条件下的保留时间，采用GPC软件计算样品的相对分子质量^[13]。色谱柱：Sepax SRT SEC-100(Φ7.8 mm×300 mm 5μ)；流动相：磷酸盐(pH 7.0)；流速：0.5 mL·min^-1；柱温：35℃；检测器：示差折光检测器。

将人参非皂苷制备成1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生物^[14]，再以各单糖的PMP衍生物作为对照品，通过HPLC法分析其组成糖。仪器：高效液相色谱仪；色谱柱：Diamonsil-C18分析柱(Φ4.6 mm×250 mm 5μ)；流动相：A，磷酸盐缓冲液(pH 6.8)∶乙腈=85∶15(体积分数)，B，磷酸盐缓冲液(pH 6.8)∶乙腈=60∶40(体积分数)；流速：0.9 mL·min^-1；柱温：40 ℃；检测波长：250 nm；进样量：10 μL。

称取20 mg人参非皂苷，加入0.5 mL脱水DMSO，密封搅拌过夜，加入0.5 mL NaOH-DMSO混悬液，密封搅拌30 min，再加0.3 mL碘甲烷，加入2 mL水终止反应，最后加入3 mL氯仿萃取，吹干氯仿层，制备成甲基化衍生物。上述甲基化衍生物经水解、还原和乙酰化后进行GC-MS分离鉴定^[15]。

样品的处理方法参照文献[16]进行。色谱柱： Agilent9 Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm)；流动相，乙腈-水(55∶45，体积分数)：KH₂PO₄缓冲液(pH 7.2)=30∶70(体积分数)；流速：1 mL·min^-1；检测器：紫外检测器；检测波长：254 nm；柱温：室温。

健康成年雄性昆明小鼠50只，体质量(20±2)g，动物合格证号：SCXK(吉)-2011-0004。随机分为对照组，模型组，阳性药组和低、中、高剂量人参糖蛋白组，每组10只。阳性药为吡拉西坦，灌胃给药剂量为9 mg·kg^-1。人参糖蛋白组大鼠灌胃给予人参糖蛋白，剂量为7.5、75.0和225.0 mg·kg^-1，连续给药30 d。

于给药第31天开始进行学习记忆训练，实验共进行3 d，第31天训练前10 min除对照组外，阳性药组，模型组，低、中和高剂量人参糖蛋白组小鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液2.5 mg·kg^-1。

给药30 d后，于第31天给药1 h后进行跳台训练，记录训练成绩，模型组，阳性药组，低、中和高剂量人参糖蛋白组小鼠腹腔注射环己酰亚胺120 mg·kg^-1，32 d时给予受试药物1 h后测试记忆成绩。

实验方法参照文献[17, 18]，并作适当修改。实验共进行7 d，前3d为获得性实验，连续3 d观察和记录小鼠寻找并爬上平台所需的时间，检测小鼠学习获得能力。第4天进行探查训练，撤去平台，记录小鼠第1次经过原平台位置的时间和穿越原平台位置的时间，检测动物空间记忆能力。第5天和第6天进行对位训练，将平台放在原平台所在象限的对侧象限，记录小鼠找到平台的时间。第7天进行对位探查训练，记录小鼠60 s内在目标象限(平台第2次所在区)所用时间。

分组和给药情况同1.4.1。末次给药1 h后，首先将小鼠置于跳台仪上，适应环境5 min后，轻放于平台上，当小鼠从跳台上跳下四肢接触铜栅时，即给予32 V电流电压刺激。记录小鼠逃避至平台上的潜伏期，并记录5 min内的触电次数(错误次数)，作为学习成绩。24 h后进行记忆成绩测试，将小鼠置于平台上，记录其停留在安全平台上的潜伏期及其3 min内受电击次数(错误次数)，若小鼠停留在平台上超过3 min，其潜伏期以180 s计。

采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。水迷宫实验中小鼠的逃避潜伏期、跨平台次数和跳台实验中小鼠停留在平台上的潜伏期及错误次数以x± s 表示。方差齐时，组间两两比较采用LSD法；方差不齐时，组间两两比较采用Tamhane法。以α=0.05为检验水准。

制得人参非皂苷的收率为相对于人参根的7%。人参非皂苷理化性质测定结果：其蛋白质量分数为19.93%，总糖质量分数为58.41%，酸性糖质量分数为9.35%。

采用GPC软件测得人参非皂苷成分相对分子质量分布在200～50 000。结合理化性质研究结果，判定人参非皂苷成分为人参糖蛋白。见图 1。

图 1 HPLC测定结果图 Fig. 1 Diagram of results of HPLC

图选项

人参糖蛋白部分中的糖部分由甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GlaNAc)和岩藻糖(Fuc)组成。其中Glc含量最高(51.32%)，其次为GlcNAc(15.90%)与GalNAc(15.50%)。见图 2。

图 2 人参糖蛋白组成糖分析结果图 Fig. 2 Diagram of sugar composition analysis of Panax ginseng glycoprotein

图选项

糖部分主链由1→4连接的Gal和1→6连接的Man组成，其非还原末端是由Rha、Glc和Gal组成，其中以Glc(59.54%)居多，而GlcNAc与GalNAc的异头碳与氨基酸相连形成糖肽键，4-位羟基与糖相连^[19]。见表 1。

人参糖蛋白由17种氨基酸组成，其含量(%)分别为Asp(7.98)、Glu(10.58)、 Ser(2.23)、His(3.31)、Gly(12.48)、 Arg(39.45)、Thr(1.77)、Pro(9.38)、Ala(5.32)、Val(1.66)、Cys(0.33)、Met(0.13)、Ile(0.75)、Leu(1.24)、Phe(0.78)、Lys(1.47)和Tyr(0.71)，其中Arg、Gly和Glu含量最高。

在获得性训练中，随着训练次数的增加，小鼠寻找水下平台的平均逃避潜伏期越来越短，表明小鼠具有通过训练学习，对水下平台的空间定位获得认知并产生记忆的能力。从第2天开始，与对照组比较，模型组小鼠的平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。从第3天开始，与模型组比较，阳性药组和高剂量人参糖蛋白组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。见表 2。

在探查训练中，与对照组比较，模型组小鼠的跨平台次数明显减少(P<0.01)、小鼠60 s内在平台所在象限t的时间明显延长(P<0.05)、小鼠60s内在平台所在象限s的时间明显缩短(P<0.05)。与模型组比较，高剂量人参糖蛋白组小鼠跨平台次数明显增加(P<0.01);与模型组比较,阳性药组和高剂量人参糖蛋白组小鼠60s内在平台所在象限s的时间明显延长(P<0.05)。见表 3。

在对位训练中，随着训练次数的增加，小鼠寻找水下平台的平均逃避潜伏期越来越短。与对照组比较,模型组小鼠的平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；与模型组比较,阳性药组，低、中和高剂量人参糖蛋白组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。见表 4。

在对位探查训练中，与对照组比较,模型组小鼠的跨平台次数明显减少(P<0.01)、小鼠60 s内在平台所在象限t的时间明显延长(P<0.05)、小鼠60 s内在平台所在象限s的时间明显缩短(P<0.01)。与模型组比较,中剂量人参糖蛋白组小鼠跨平台次数(P<0.05)，与模型组比较,高剂量人参糖蛋白组小鼠60 s内在平台所在象限s的时间明显延长(P<0.01)。见表 5。

在跳台试验中，与对照组比较,模型组小鼠停留在平台上的潜伏期明显缩短(P<0.05)，小鼠3 min内的错误次数明显增加(P<0.05)。与模型组比较,阳性药组，低、中和高剂量人参糖蛋白组小鼠3 min内的错误次数明显减少(P<0.05)。与模型组比较，阳性药组、中剂量人参糖蛋白组小鼠停留在平台上的潜伏期明显延长(P<0.05)。见表 6。

本研究结果表明：人参水提物中的糖蛋白组分具有增强学习记忆的作用，且显示出良好的量效关系。这一结果证明：人参所具有增强学习记忆作用的活性物质非仅皂苷类成分，尽管关于人参总皂苷或单体皂苷增强学习记忆方面的研究已有大量报道，但通过对文献[1, 2, 3, 4, 5, 6, 21, 22]结果系统分析得出：人参单体皂苷或总皂苷的有效剂量如折算到人参药材的日用量，其服用剂量应达到50～400 g·d^-1方可显示功效，赵莹等^[1]发现：给予大鼠人参单体皂苷Re 12.5 mg·kg^-1时具有提高学习和记忆能力的作用，换算为人用人参药材为每日36.2 g·60 kg^-1。陈新梅等^[2]研究发现：使用人参皂苷Rg1脂质体20 mg·kg^-1时，对东莨菪碱诱导的大鼠学习和记忆障碍具有改善作用，换算为人用人参药材为每日56.4 g·60kg^-1。王晓英等^[3]发现：使用人参皂苷Rg1 10 mg·kg^-1时，对β淀粉样蛋白造模的小鼠学习和记忆损伤具有明显的治疗作用，换算为人用人参药材为每日19.8 g·60kg^-1。上述结果均超出国家药典和保健食品所规定的法定用量。本研究结果表明：如以人参糖蛋白作为活性物质，其增强学习和记忆能力的有效剂量折算到人参药材的日用量为3～6 g·d^-1即可显示出明显的作用，表明人参水提物中糖及复合物具有很多的生物活性，人参糖蛋白组分也是增强学习和记忆能力的活性成分之一。本研究结果为人参作用机制方面的深入探讨提供了科学依据，同时为拓宽人参用途、促进人参产业链的健康发展奠定了基础。