肺结核在全世界有极高的感染率及死亡率，并且感染人数呈逐年上升趋势，而我国是世界肺结核高发病的大国^{[1, 2]}。目前，肺结核在临床上仍以痰培养结核分枝杆菌阳性为诊断的金标准，但是因为结核菌生长缓慢，培养耗时长而不利于临床上对肺结核患者的早期诊断与治疗^[3]。以往临床常用检验方法有痰涂片检菌、痰聚合酶链式反应(PCR)检测结核杆菌DNA、结核抗体及影像学和病理学检查，但敏感性、检出率低，无法满足临床上实际的需要^{[4, 5, 6]}，因此找到简易快捷的诊断方法具有重要意义。腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)是嘌呤核苷酸代谢中一种重要的水解酶，胸水ADA检测主要用于鉴别临床症状相似患者胸腹水的良恶性，而血清ADA检测用于肺结核诊断的研究^[7]较少。结核感染T细胞斑点试验(T-spot.TB)是近些年诊断肺结核的又一新方法，主要检测结核杆菌特异性抗原早期分泌抗原(ESAT-6)和培养滤过蛋白(CFP-10))刺激T淋巴细胞产生的γ干扰素(IFN-γ)^[8]。本研究旨在通过血清ADA水平和T-spot.TB检测及两者联合检测，探讨其在肺结核诊断中的价值。

选取本院2014年1月—2015年4月疑诊为肺结核患者159例，其中男性97例，女性62例，年龄为23～75岁，中位年龄为46岁。根据肺结核的诊断标准^[9]:痰培养阳性；病理活检发现肉芽肿性炎症或干酪样坏死；痰涂片、抗酸染色阳性。将上述患者分为肺结核组和非肺结核组。结核组患者91例，男性55例，女性36例，年龄23～59岁，中位年龄为39岁。非肺结核组患者68例，包括肺癌患者24例，肺炎患者41例，3例患者病历资料不全；其中男性39例，女性29例,年龄为31～75岁，中位年龄为45岁。随机选取健康体检者80名作为对照组，其中男性40名，女性40名，年龄为23～75岁，中位年龄为45岁。

采用BD公司真空采血管采集各组受试者静脉血。3mL血清标本用于血清ADA检测，6mL肝素抗凝血全血标本用于T-spot.TB检测。

采用贝克曼全自动生化仪AU5800进行检测，ADA检测试剂盒(酶法)购自重庆中元生物技术有限公司，正常参考范围为4～24U·L^-1。

T-spot.TB检测试剂盒由英国Oxford Immunotec公司生产，严格遵守说明书操作。检测方法简述如下：通过RPMI1640培养液及Ficoll淋巴细胞分离液，获取血浆中的单个核细胞(PBMCs)，用AIM-V培养液配置标准溶液，使PBMCs浓度为2.5×10⁵ mL^-1待用。取出T-spot.TB试剂盒微孔板，在板上4个微孔依次加入50μL AIM-V培养液作为阴性对照孔，50μL植物血凝素(PHA)作为阳性对照孔，50μL结核分枝杆菌特异抗原ESAT-6作为A检测孔及50μL抗原CFP-10作为B检测孔。最后在4个微孔中各加入100μL标准溶液。微孔板放在37℃、5% CO₂培养箱孵育16～20 h。PBS洗板4次，加入碱性磷酸酶标记二抗。2℃～8℃孵育60 min。再用PBS洗板4次，加入底物显色溶液。室温孵育7 min。用蒸馏水或去离子水充分洗涤终止反应。用放大镜计数每个孔中有颜色斑点。

结果判定：①阴性对照孔点数为0～5，检测孔抗原A或抗原B斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6，判断为阳性;②阴性对照孔斑点数≥6，检测孔抗原A或抗原B斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数，判断为阳性。

血清ADA测试水平参考值上线为临界值，大于或者等于临界值为阳性，小于临界值为阴性。敏感性=肺结核组测定指标的阳性例数/肺结核组例数，特异性=(非肺结核组+对照组)测定指标的阴性例数/(非肺结核组例数+对照组例数)。平行试验联合检测法：即血清ADA水平测试和T.Spot TB中有任何一项为阳性即为联合检验的阳性；系列试验联合检测法：即2项试验均为阳性即为联合检验的阳性。阳性预测值=肺结核组测定指标的阳性例数/(肺结核组测定的阳性例数+非肺结核组测定的阳性例数+对照组测定的阳性例数)。阴性预测值=(非肺结核组+对照组)测定指标的阴性例数/(肺结核组测定的阴性例数+非肺结核组测定的阴性例数+对照组测定的阴性例数)。

血清ADA水平采用诊断性实验检验标准可信区间为95%，对血清ADA诊断肺结核采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)进行评价。

采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。各组受试者血清ADA水平以x± s 表示，组间比较采用两独立样本t检验，各组间率的比较采用χ²检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

肺结核组患者血清ADA水平高于非肺结核组和健康对照组(P<0.05)。肺结核组患者T-spot.TB阳性例数多于非肺结核组和健康对照组。见表 1。

肺结核组患者血清ADA阳性率为56.0%,似然比为4.9；T-spot.TB阳性率为87.9%,似然比为5.2；肺结核组2种检测方法阳性率明显高于非肺结核组和健康对照组(P<0.05)，且2种检测方法一致率为52.7%。见表 2。

以敏感性为纵坐标,1-特异性为横坐标绘制血清ADA水平对肺结核诊断的ROC(图 1)。肺结核患者血清ADA水平明显升高，对诊断肺结核具有较高的敏感性和特异性，ROC下面积为0.932；为达到总体诊断符合率最大，选择ROC左上角的值作为诊断的临界值^[10]，诊断临界值为12.55 U·L^-1，灵敏度为91.2%，特异性为83.8%，最大约登指数为0.75。

图1 血清ADA水平诊断肺结核的准确率 Fig.1 Accuracy of serum ADA level in diagnosis of pulmonary tuberculosis

图选项

血清ADA水平对肺结核诊断的特异性较高(88.5%)，T-spot.TB对肺结核诊断的敏感性较高(86.8%)。采用平行联合检测法，可以提高对肺结核诊断的敏感性(91.2%)和阴性预测值(93.4%)，而特异性和阳性预测值下降；采用系列联合检测法，可以提高检测的特异性(95.3%)和阳性预测值(87.3%)，而敏感度值和阴性预测值下降。见表 3。

ADA广泛存在于人体各种组织和细胞中，血液中ADA主要存在于红细胞、粒细胞和淋巴细胞中^[11]。相关文献[12, 13, 14]显示：人体淋巴细胞内ADA水平是红细胞的10倍，并且ADA水平与淋巴细胞的激活及分化有关，而与数量无关，在T淋巴细胞中ADA水平要高于B淋巴细胞。而肺结核是由T淋巴细胞介导的细胞免疫。1987年Piras等^[15]首次报道结核性胸水ADA水平明显升高，随后Kartaloglu等^[16]报道肺结核患者血清ADA水平明显升高。本研究结果显示:肺结核组患者血清ADA水平明显高于非肺结核组和健康对照组患者，差异有统计学意义。血清ADA对肺结核诊断的ROC下面积为0.932，说明血清ADA可以作为鉴别诊断肺结核重要的标志物。

T-spot.TB是近些年实验室诊断肺结核的有效手段之一，其是γ干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)的一种检测技术，IGRA原理是当机体感染结核杆菌刺激，机体产生记忆T淋巴细胞，当再次受到结核杆菌的特异抗原刺激，这些记忆T淋巴细胞迅速增殖成为效应T淋巴细胞，分泌INF-γ和其他一些细胞因子来刺激T淋巴细胞增殖并可以激活巨噬细胞^{[17, 18]}。

T-spot.TB是检测早期分泌抗原(ESAT-6)和培养滤过蛋白(CFP-10)这2个抗原刺激时淋巴细胞分泌的INF-γ，计数荧光标记释放TNF-γ的T淋巴细胞的个数来了解机体是否处于结核杆菌感染状态^[19]。本研究中T-spot.TB诊断肺结核的灵敏度是86.8%，特异度是83.1%，说明T-spot.TB诊断肺结核具有较高的灵敏度与特异性。

本研究对结核病患者进行血清ADA水平与T-spot.TB联合检测，运用平行联合检测法，发现诊断灵敏度显著升高(91.2%)，对提高早期诊断肺结核具有重要的临床意义；采用系列联合试验，特异度显著提高(94.6%)，对指导临床治疗有价值。单独采用T-spot.TB检测阳性患者，由于记忆T细胞在体内的长期存在，无法诊断患者是否为活动性肺结核，通过联合血清ADA检测，可以协助指导临床对既往感染肺结核患者再复发的诊断。

综上所述，联合血清ADA检测与T-spot.TB 2种检测方法能够显著提高对肺结核诊断的灵敏度与特异度，结合临床症状可对疑似肺结核患者进行快速准确的诊断。作为临床一项重要的诊断辅助手段，联合检测具有较好的临床应用价值。