吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (02): 290-294

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金霖霖, 邵立虹, 魏威, 董卓, 袁天阳, 高辉, 韩海玲, 从宪玲, 金顺子
JIN Linlin, SHAO Lihong, WEI Wei, DONG Zhuo, YUAN Tianyang, GAO Hui, HAN Hailing, CONG Xianling, JIN Shunzi
NRP1和miR-9在人NSCLC组织和癌旁组织中的表达及其临床意义
Expressions of miR-9 and NRP1 in human NSCLC tissue and adjacent carcinoma tissueand their clinical significances
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(02): 290-294
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(02): 290-294
10.13481/j.1671-587x.20160219

文章历史

收稿日期: 2015-07-21
NRP1和miR-9在人NSCLC组织和癌旁组织中的表达及其临床意义
金霖霖1, 邵立虹1, 魏威1, 董卓1, 袁天阳1, 高辉1, 韩海玲1, 从宪玲2 , 金顺子1     
1. 吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室, 吉林长春 130021;
2. 吉林大学中日联谊医院组织标本库, 吉林长春 130033
摘要: 目的: 检测人非小细胞肺癌(NSCLC)组织标本中神经纤毛蛋白1(NRP1)mRNA和miR-9的表达水平,并探讨二者表达与NSCLC患者临床特征之间的关系。方法: 在患者知情同意下,收集2010-2011年吉林大学中日联谊医院匹配的NSCLC患者组织标本,包括45例正常组织、45例癌旁组织及45例肿瘤组织。采用qRT-PCR法检测不同组织中NRP1 mRNA和miR-9表达水平,分析二者表达水平与不同临床病理特征的相关性。结果: 与正常组织比较,癌旁组织中NRP1 mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),而肿瘤组织中NRP1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05);与正常组织比较,癌旁组织miR-9表达水平无明显变化(P>0.05),而肿瘤组织中miR-9表达水平明显升高(P<0.05)。男性癌旁组织中miR-9表达水平低于女性(P<0.05)。NSCLC患者肿瘤组织中NRP1 mRNA表达水平与性别、年龄、分化程度、TNM分期及临床分期无关联(P>0.05),但与病理分型及淋巴结转移有关联(P<0.05);NSCLC患者肿瘤组织中miR-9表达水平与年龄、肿瘤病理类型、淋巴转移、分化程度、TNM分期及临床分期无关联(P>0.05),而与性别因素有关联(P<0.05)。结论: NSCLC患者肿瘤组织中miR-9表达水平显著升高,而NRP1 mRNA表达水平明显下降,NRP1 mRNA检测有助于判断NSCLC的分型及转移。
关键词: 神经纤毛蛋白1    miR-9    癌,非小细胞肺    临床病理特征    
Expressions of miR-9 and NRP1 in human NSCLC tissue and adjacent carcinoma tissueand their clinical significances
JIN Linlin1, SHAO Lihong1, WEI Wei1, DONG Zhuo1, YUAN Tianyang1, GAO Hui1, HAN Hailing1, CONG Xianling2, JIN Shunzi1     
1. Key Laboratory of Radiobiology, Ministry of Health, School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021, China;
2. Tissue Samples Library, China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130033, China
Abstract: Objective: To detect the expression levels of neuropilin1(NRP1) mRNA and miR-9 in non-small cell lung cancer (NSCLC) tissue samples, and to explore the correlations between the expressions of NRP1 mRNA, miR-9 and the clinicopathological characteristics of the patients with NSCLC. Methods: Informed consent was obtained from each patient before surgery.The tissue samples including 45 NSCLC tissue, 45 adjacent carcinoma tissue and 45 normal lung tissue were collected from China-Japan Union Hospital of Jilin University from 2010 to 2011. qRT-PCR was used to detect the expression levels of NRP1 mRNA and miR-9 in three kinds of lung tissue, and the correlation between the expressions of NRP1 mRNA, miR-9 and clinicopathological characteristics of the patients with NSCLC was analyzed.Results: Compared with normal tissue, the expression level of NRP1 mRNA in adjacent carcinoma tissue had no change(P>0.05), but the expression level of NRP1 mRNA in non-small cell lung cancer tissue was significantly decreased (P<0.05).Compared with normal tissue, the expression level of miR-9 in adjacent carcinoma tissue had no change(P>0.05), but the expression level of miR-9 in non-small cell lung cancer tissue was significantly increased (P<0.05).Furthermore, in adjacent carcinoma tissue, the expression level of miR-9 in the males was lower than that in the females(P<0.05).In NSCLC tissue, the expression level of NRP1 mRNA had no relationship with sex, age, differentiation degree, TNM stage and clinical stage, but was significantly correlated to the histological subtype and lymph node metastasis (P<0.05). In NSCLC tissue, the expression level of miR-9 had no relationship with age, pathological type, lymph node metastasis, differentiation degree, TNM stage, and clinical stage (P>0.05), but was correlated to the sex(P<0.05).Conclusion: The expression level of miR-9 is up-regulated and the expression level of NRP1 mRNA is down-regulated significantly in non-small cell lung cancer tissue.The detection of the expression level of NRP1 mRNA contributes to judge the histological subtype and lymph node metastasis of NSCLC.
Key words: neuropilin1    miR-9    carcinoma, non-small cell lung    clinicopathological characteristics    

目前,肺癌的发病率和病死率仍高于其他癌症。虽然近年来手术、化疗等综合治疗改善了肿瘤的治疗效果,但肺癌5年生存率仍约为16%[1]。随着肿瘤分子生物学研究的进展,肺癌的分子靶向治疗已越来越受到人们关注,并广泛应用于临床治疗。神经纤毛蛋白1(neuropilin1,NRP1)是一种新型的多功能受体,作为神经丛蛋白的共受体参与神经细胞导向和轴突生长的调控;同时也作为血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)的共受体,对内皮细胞的活化、增殖与迁移进行调控[2]。研究[3, 4]表明:NRP1在膀胱癌和乳腺癌等多种肿瘤中均表达异常,与肿瘤细胞生长和肿瘤血管生成密切相关,可作为许多肿瘤进展期的标志物之一。miRNAs是一组单链非编码RNA,长约22个核苷酸,广泛存在于真核细胞中;通过与靶基因的3′-UTR结合,在转录后水平控制基因的表达,可在多种肿瘤中异常表达。研究[5, 6, 7]表明:miR-9在多种人体肿瘤细胞中异常表达,如在神经系统肿瘤中表达上调,在乳腺癌等肿瘤中表达下调。与正常组织比较,喉鳞状细胞癌组织中miR-9呈高表达,且其高表达与患者临床分期及淋巴结转移等有关。

本研究探讨非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)患者临床标本中NRP1 mRNA和miR-9的表达情况,并分析二者与NSCLC临床病理特征之间的关系,为肺癌的临床诊断及治疗提供依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

在患者知情同意下,收集2010—2011年来源于吉林大学中日联谊医院的45套匹配的NSCLC患者的组织标本,包括正常组织、癌旁组织及肿瘤组织,其中男性31例,女性14例;年龄41 ~ 79岁,平均年龄58岁;按病理分型分为:腺癌23例,鳞状细胞癌22例;按分化程度分为:低分化13例,中分化31例,高分化1例;按是否发生淋巴结转移分为:淋巴结转移26例,未发生淋巴结转移19例;按临床分期分为:Ⅰ-Ⅱ期34例,Ⅲ- Ⅳ期11例;按TNM分期分为:T1期12例,T2期32例,T3期1例。所有组织均经组织病理学确诊,有详细的临床资料及病历资料,均未进行术前放、化疗。

1.2 主要试剂

Hairpin-itTM miR-9和U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit购自上海吉玛制药技术有限公司;NRP1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,序列为:Forward,5′-CCCCAAACCACTGATAACTCG-3′,Reverse,5′-A-GACACCATACCCAACATTCC-3′,其逆转录及实时定量试剂盒购买自大连宝生物公司。

1.3 qRT-PCR法检测miR-9和NRP1 mRNA的表达

按照说明书配制各自的反应体系,miR-9检测以U6为内参基因,NRP1检测以GAPDH为内参基因,加入组织cDNA后在Real-time PCR仪(BIO-RAD,CFX-96)上完成实验。结果采用比较阈值法分析,即目的基因的量=2-ΔΔCt,ΔΔCt=(实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)。

1.4 统计学分析

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。NRP1 mRNA及miR-9的表达水平用中位数(四分位数间距)方法表示。使用Kolmogorov-Smirnov法检测3组基因表达的分布情况。采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验进行组间比较;采用χ2检验或Fisher’s Exact Test分析比较miR-9或NRP1与临床病理学参数之间的关系;采用双变量Spearman秩和相关分析检测NRP1 mRNA及miR-9表达水平的相关性;P值选用双侧。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同类型肺组织中NRP1 mRNA的表达水平

与正常组织(1.00)比较,癌旁组织中NRP1 mRNA表达水平(0.96,0.68~1.41)无明显变化(P>0.05),而NSCLC肿瘤组织中NRP1 mRNA表达水平(0.14,0.06~0.27)明显降低(P < 0.05)。

2.2 不同类型肺组织中miR-9的表达水平

与正常组织(1.00)比较,癌旁组织中miR-9表达水平(1.04,0.57~3.22)无明显变化(P>0.05),而NSCLC肿瘤组织中miR-9表达水平(3.07,0.65~21.59)明显升高(P < 0.05)。

2.3 NSCLC组织中NRP1 mRNA和miR-9表达的相关性

相关分析结果显示:在NSCLC组织中NRP1 mRNA与miR-9表达无相关性(r2=-0.093,P=0.545)。

2.4 NSCLC患者肺组织中NRP1 mRNA和miR-9表达与不同临床病理学参数的相关性

NSCLC患者肺组织中NRP1 mRNA表达与患者性别、年龄、分化程度、TNM分期及临床分期无关联(P>0.05),而与肿瘤病理类型及淋巴结转移有关联(P < 0.05)。见表 1。在NSCLC患者中miR-9表达与患者年龄、肿瘤病理类型、淋巴结转移、分化程度、TNM分期及临床分期无关联(P>0.05),而与性别因素有关联(P < 0.05)。见表 2

表1 不同临床病理特征NSCLC患者肺组织中NRP1 mRNA表达 Tab.1 Expressions of NRP1 mRNA in lung tissue of NSCLC patients with different clinicopathological characteristics
(n=45)
Variablen N-T NRP1 expressionPN-P NRP1 expressionPP-T NRP1 expressionP
HighLowHighLowHighLow
Gender
Male
Female
31
14
14
8
17
6
0.45716
6
15
8
0.58614
7
17
7
0.763
Age (year)
≥ 60
< 60
18
27
9
13
9
14
0.9038
14
10
13
0.6269
12
9
15
0.714
Histological subtype
Adenocarcinoma
Squamous cell carcinoma
23
22
17
5
6
17
0.001*13
9
10
13
0.29514
7
9
15
0.051
Differentiation degree
Low13586767
Moderate3117140.42015161.00015160.633
High1011001
Lymph node metastasis
Positive
Negative
26
19
16
6
10
13
0.047*12
10
14
9
0.66815
6
11
13
0.083
Clinical stage
Ⅰ+Ⅱ
Ⅲ+Ⅳ
34
11
14
8
20
3
0.06918
4
16
7
0.33915
6
19
5
0.547
TNM Stage
T112754875
T23214180.40517150.31413190.322
T31101010
N: Normal lung tissue; P: Adjacent carcinoma tissue; T: NSCLC tissue. *P < 0.05 compared between normal lung tissue and NSCLC tissue. Fisher’s Exact Test.
表2 不同临床病理特征NSCLC患者肺组织中miR-9表达 Tab.2 Expressions of miR-9 in lung tissue of NSCLC patients with different clinicopathological characteristics
(n=45)
Variablen N-T miR-9 expressionPN-P miR-9 expressionPP-T miR-9 expressionP
HighLowHighLowHighLow
Gender
Male
Female
31
14
13
9
18
5
0.16512
10
19
4
0.042*15
8
16
6
0.586
Age (year)
≥ 60
< 60
18
27
9
13
9
14
0.9037
15
11
12
0.2739
14
9
13
0.903
Histological subtype
Adenocarcinoma
Squamous cellcarcinoma
23
22
10
12
13
10
0.45812
10
11
12
0.65211
12
12
10
0.652
Differentiation degree
Low13858576
Moderate3113180.25413180.25415161.000
High1101010
Lymph node metastasis
Positive
Negative
26
19
13
9
13
10
0.86212
10
14
9
0.66813
10
13
9
0.862
Clinical stage
Ⅰ+Ⅱ
Ⅲ+Ⅳ
34
11
16
6
18
5
0.66615
7
19
4
0.26018
5
16
6
0.666
TNM Stage
T112935775
T23213190.06617150.62216160.738
T31010101
N: Normal lung tissue; P: Adjacent carcinoma tissue; T: NSCLC tissue. *P < 0.05 compared between normal lung tissue and adjacent carcinoma tissue. Fisher’s Exact Test.
3 讨论

NRP1又称CD304或BDCA-4,是表达在细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于neuropilins家族的成员,其相对分子质量为120000~130000。NRP1是一种多功能受体,在神经系统、血管系统和肿瘤中起到至关重要的作用。作为脑信号蛋白3A(Sema3A)和VEGFR的共受体,NRP1表达于肿瘤细胞及血管系统中,与肿瘤组织血管生成、肿瘤发展相关。有文献[8]报道:在神经胶质瘤中NRP1呈现高表达,且NRP1表达越高,肿瘤恶性程度越高;NRP1通过促进肿瘤血管生成,降低患者的总生存期,引发不良预后。在人前列腺中,NRP1的高表达与患者较低总生存期有关[9]。另有文献[10]报道:NRP1和肝细胞生长因子受体(C-MET)对NSCLC发生、发展过程中血管生成的促进作用明显,且NRP1和C-MET对肿瘤的发生和生长有重要的作用。本研究结果显示:相较于匹配的正常组织及癌旁组织,NSCLC患者肿瘤组织中NRP1 mRNA呈现明显的低表达,这与以往报道有所不同,可能与检测的病理标本分组不同(大多数文献中观察的是肿瘤组织中的表达高低水平,而本实验中选择的是匹配的正常组织、癌旁组织和肿瘤组织)及肿瘤特异性等有关。同时发现:NRP1 mRNA的低表达与患者的病理分型及淋巴结转移有关,腺癌患者中其表达明显高于鳞状细胞癌患者,有淋巴结转移的患者其表达明显高于无淋巴结转移的患者。这些结果提示:NRP1 mRNA在肿瘤组织中低表达,但其低表达与NSCLC患者的预后不良有关。

miRNAs是真核生物体内一组内源性的单链非编码小RNA,长约22个核苷酸。通过碱基配对与靶基因mRNA序列中的3′-UTR结合,引起mRNA降解或转录抑制,从而抑制靶蛋白合成及其功能的发挥[11]。miRNA功能的揭示将成为人类认识和攻克肿瘤的一个重要突破口,而miRNA靶基因的确定是研究其生物学功能的关键。本课题组曾通过体外实验研究[12]确认:NRP1与miR-9有靶向关系,阐明了miR-9通过靶向调控NRP1,进而提高肺癌细胞的放射敏感性。

miR-9在多种肿瘤组织中异常表达,且已经证实其在肿瘤发生、发展中所起的作用。有文献[13]报道:人神经胶质瘤组织中,高表达的miR-9可作为肿瘤进展及预后的标志物,尤其是针对临床晚期的患者。在人上皮性卵巢癌中,miR-9的低表达与患者较低的无病生存期及总生存期有关[14]。另有研究[15]显示:与早期肝癌比较,晚期肝癌患者肿瘤组织中miR-9表达水平升高,且高表达miR-9与临床分期及总生存期下降呈正相关关系。以上结果显示:在肿瘤发生发展过程中,高表达miR-9起到关键作用,并能引起患者不良预后。本研究中,与正常组织和癌旁组织比较,肿瘤组织中miR-9的表达水平明显升高,这与以往的报道[16]结果相同,男性癌旁组织中miR-9表达更低;但miR-9表达与患者病理分型、淋巴结转移等临床病理特征之间未得出任何相关性。产生这种现象的原因可能为:①与正常组织相比,肿瘤组织中miR-9最高可表达112.1倍,最低则为0.006倍,人与人之间有较大的个体差异,这种不可抗因素,可能导致相关性的缺失;②与以往研究相比,本研究样本量较小,也可能导致这种现象的出现。

本研究中miR-9与NRP1表达趋势是相反的,但无负相关关系,可能是因为miRNA不影响靶基因mRNA表达,而是在靶基因的蛋白翻译过程中起调控作用。因此本课题组将进一步探讨NRP1蛋白表达变化及与miR-9的相关性。

综上所述,NSCLC患者肿瘤组织中miR-9高表达,且NRP1 mRNA低表达,NRP1 mRNA的检测有助于判断NSCLC的分型及转移。

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