目前，肺癌的发病率和病死率仍高于其他癌症。虽然近年来手术、化疗等综合治疗改善了肿瘤的治疗效果，但肺癌5年生存率仍约为16%^[1]。随着肿瘤分子生物学研究的进展,肺癌的分子靶向治疗已越来越受到人们关注，并广泛应用于临床治疗。神经纤毛蛋白1(neuropilin1,NRP1)是一种新型的多功能受体，作为神经丛蛋白的共受体参与神经细胞导向和轴突生长的调控;同时也作为血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)的共受体，对内皮细胞的活化、增殖与迁移进行调控^[2]。研究^{[3, 4]}表明：NRP1在膀胱癌和乳腺癌等多种肿瘤中均表达异常，与肿瘤细胞生长和肿瘤血管生成密切相关，可作为许多肿瘤进展期的标志物之一。miRNAs是一组单链非编码RNA，长约22个核苷酸，广泛存在于真核细胞中;通过与靶基因的3′-UTR结合，在转录后水平控制基因的表达，可在多种肿瘤中异常表达。研究^{[5, 6, 7]}表明:miR-9在多种人体肿瘤细胞中异常表达，如在神经系统肿瘤中表达上调，在乳腺癌等肿瘤中表达下调。与正常组织比较，喉鳞状细胞癌组织中miR-9呈高表达，且其高表达与患者临床分期及淋巴结转移等有关。

本研究探讨非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)患者临床标本中NRP1 mRNA和miR-9的表达情况，并分析二者与NSCLC临床病理特征之间的关系，为肺癌的临床诊断及治疗提供依据。

在患者知情同意下，收集2010—2011年来源于吉林大学中日联谊医院的45套匹配的NSCLC患者的组织标本，包括正常组织、癌旁组织及肿瘤组织，其中男性31例，女性14例;年龄41 ~ 79岁，平均年龄58岁;按病理分型分为：腺癌23例，鳞状细胞癌22例;按分化程度分为：低分化13例，中分化31例，高分化1例;按是否发生淋巴结转移分为：淋巴结转移26例，未发生淋巴结转移19例;按临床分期分为：Ⅰ-Ⅱ期34例，Ⅲ- Ⅳ期11例;按TNM分期分为：T1期12例，T2期32例，T3期1例。所有组织均经组织病理学确诊，有详细的临床资料及病历资料，均未进行术前放、化疗。

Hairpin-it^TM miR-9和U6 snRNA Normalization RT-PCR Quantitation Kit购自上海吉玛制药技术有限公司;NRP1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列为：Forward，5′-CCCCAAACCACTGATAACTCG-3′，Reverse，5′-A-GACACCATACCCAACATTCC-3′，其逆转录及实时定量试剂盒购买自大连宝生物公司。

按照说明书配制各自的反应体系，miR-9检测以U6为内参基因，NRP1检测以GAPDH为内参基因，加入组织cDNA后在Real-time PCR仪(BIO-RAD，CFX-96)上完成实验。结果采用比较阈值法分析，即目的基因的量=2^-ΔΔCt，ΔΔCt=(实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)。

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。NRP1 mRNA及miR-9的表达水平用中位数(四分位数间距)方法表示。使用Kolmogorov-Smirnov法检测3组基因表达的分布情况。采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验进行组间比较;采用χ²检验或Fisher’s Exact Test分析比较miR-9或NRP1与临床病理学参数之间的关系;采用双变量Spearman秩和相关分析检测NRP1 mRNA及miR-9表达水平的相关性;P值选用双侧。以P < 0.05为差异有统计学意义。

与正常组织(1.00)比较，癌旁组织中NRP1 mRNA表达水平(0.96，0.68~1.41)无明显变化(P>0.05)，而NSCLC肿瘤组织中NRP1 mRNA表达水平(0.14,0.06~0.27)明显降低(P < 0.05)。

与正常组织(1.00)比较，癌旁组织中miR-9表达水平(1.04，0.57~3.22)无明显变化(P>0.05)，而NSCLC肿瘤组织中miR-9表达水平(3.07,0.65~21.59)明显升高(P < 0.05)。

相关分析结果显示：在NSCLC组织中NRP1 mRNA与miR-9表达无相关性(r²=-0.093，P=0.545)。

NSCLC患者肺组织中NRP1 mRNA表达与患者性别、年龄、分化程度、TNM分期及临床分期无关联(P>0.05)，而与肿瘤病理类型及淋巴结转移有关联(P < 0.05)。见表 1。在NSCLC患者中miR-9表达与患者年龄、肿瘤病理类型、淋巴结转移、分化程度、TNM分期及临床分期无关联(P>0.05)，而与性别因素有关联(P < 0.05)。见表 2。

NRP1又称CD304或BDCA-4，是表达在细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于neuropilins家族的成员，其相对分子质量为120000~130000。NRP1是一种多功能受体，在神经系统、血管系统和肿瘤中起到至关重要的作用。作为脑信号蛋白3A(Sema3A)和VEGFR的共受体，NRP1表达于肿瘤细胞及血管系统中，与肿瘤组织血管生成、肿瘤发展相关。有文献[8]报道：在神经胶质瘤中NRP1呈现高表达，且NRP1表达越高，肿瘤恶性程度越高;NRP1通过促进肿瘤血管生成，降低患者的总生存期，引发不良预后。在人前列腺中，NRP1的高表达与患者较低总生存期有关^[9]。另有文献[10]报道：NRP1和肝细胞生长因子受体(C-MET)对NSCLC发生、发展过程中血管生成的促进作用明显，且NRP1和C-MET对肿瘤的发生和生长有重要的作用。本研究结果显示：相较于匹配的正常组织及癌旁组织，NSCLC患者肿瘤组织中NRP1 mRNA呈现明显的低表达，这与以往报道有所不同，可能与检测的病理标本分组不同(大多数文献中观察的是肿瘤组织中的表达高低水平，而本实验中选择的是匹配的正常组织、癌旁组织和肿瘤组织)及肿瘤特异性等有关。同时发现：NRP1 mRNA的低表达与患者的病理分型及淋巴结转移有关，腺癌患者中其表达明显高于鳞状细胞癌患者，有淋巴结转移的患者其表达明显高于无淋巴结转移的患者。这些结果提示：NRP1 mRNA在肿瘤组织中低表达，但其低表达与NSCLC患者的预后不良有关。

miRNAs是真核生物体内一组内源性的单链非编码小RNA，长约22个核苷酸。通过碱基配对与靶基因mRNA序列中的3′-UTR结合，引起mRNA降解或转录抑制，从而抑制靶蛋白合成及其功能的发挥^[11]。miRNA功能的揭示将成为人类认识和攻克肿瘤的一个重要突破口，而miRNA靶基因的确定是研究其生物学功能的关键。本课题组曾通过体外实验研究^[12]确认：NRP1与miR-9有靶向关系，阐明了miR-9通过靶向调控NRP1，进而提高肺癌细胞的放射敏感性。

miR-9在多种肿瘤组织中异常表达，且已经证实其在肿瘤发生、发展中所起的作用。有文献[13]报道：人神经胶质瘤组织中，高表达的miR-9可作为肿瘤进展及预后的标志物，尤其是针对临床晚期的患者。在人上皮性卵巢癌中，miR-9的低表达与患者较低的无病生存期及总生存期有关^[14]。另有研究^[15]显示：与早期肝癌比较，晚期肝癌患者肿瘤组织中miR-9表达水平升高，且高表达miR-9与临床分期及总生存期下降呈正相关关系。以上结果显示：在肿瘤发生发展过程中，高表达miR-9起到关键作用，并能引起患者不良预后。本研究中，与正常组织和癌旁组织比较，肿瘤组织中miR-9的表达水平明显升高，这与以往的报道^[16]结果相同，男性癌旁组织中miR-9表达更低;但miR-9表达与患者病理分型、淋巴结转移等临床病理特征之间未得出任何相关性。产生这种现象的原因可能为：①与正常组织相比，肿瘤组织中miR-9最高可表达112.1倍，最低则为0.006倍，人与人之间有较大的个体差异，这种不可抗因素，可能导致相关性的缺失;②与以往研究相比，本研究样本量较小，也可能导致这种现象的出现。

本研究中miR-9与NRP1表达趋势是相反的，但无负相关关系，可能是因为miRNA不影响靶基因mRNA表达，而是在靶基因的蛋白翻译过程中起调控作用。因此本课题组将进一步探讨NRP1蛋白表达变化及与miR-9的相关性。

综上所述，NSCLC患者肿瘤组织中miR-9高表达，且NRP1 mRNA低表达，NRP1 mRNA的检测有助于判断NSCLC的分型及转移。