神经母细胞瘤是婴幼儿时期最常见的恶性实体瘤之一^[1]。手术、化疗和放疗是其治疗的三大主要手段。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也给机体带来极大的毒副作用,严重影响儿童的身心健康。因此,寻找一种低毒高效的化疗药物十分必要。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是从天然植物中提取出来的,已作为抗疟药在临床上广泛应用。DHA具有吸收好、分布广、排泄和代谢迅速、高效、低毒等优点。研究^{[2, 3]}表明:DHA对多种癌细胞均具有明显的杀伤作用,且对正常细胞的生长影响较小,但其对神经母细胞瘤的作用及机制国内外尚未见相关报道。因此,本实验通过研究DHA对SH-SY5Y细胞生长的作用,探讨其可能的抗肿瘤机制。

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株由吉林医药学院科研实验中心提供。DHA(中国成都欧康植化科技有限公司);DMEM培养液(美国Hyclone公司);0.25%胰酶和小牛血清(美国Gibco公司);二甲基亚枫(DMSO)和四甲基偶氮唑(MTT)(美国Sigma公司);caspase-3抗体、β-actin 和cyclin D1(北京中杉公司)。将DHA溶于DMSO中,配成50mmol·L^-1浓度的原液备用。CB150型CO₂培养箱(德国Binder公司);J-26XP型超低温高速离心机(美国贝克曼公司);PLUS 384型全自动酶标仪(美国MDC公司);IX-70型倒置式显微镜(日本Olympus公司);流式细胞仪(EpicsXL,美国贝克曼公司);DNA蛋白电泳系统(美国Bio-Rad公司);Image-Pro Plus 图像分析管理系统(美国MediaCybernetics公司)。

将冻存的SH-SY5Y细胞迅速置入37℃水浴中振荡至融解,离心后将细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液混匀,将细胞悬液接种于25cm²培养瓶置入细胞培养箱中,在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下进行培养,隔日换液,按1∶3比例进行传代。

将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞制成单细胞悬液,按每孔5×10³个细胞的密度将细胞均匀种于96孔板中,置于37℃、5% CO₂及饱和湿度条件下培养过夜。将细胞分为空白对照组和4个加药组,次日加入不同浓度DHA的培养液(药物终浓度分别为0、0.05、0.50、5.00和50.00μmol·L^-1,基础培养液用含5%小牛血清的DMEM培养液),分别作用24、48和72h时,每个浓度设5个复孔,实验重复3次。终止实验前每孔加入MTT 20 μL(5g·L^-1)继续孵育4 h,弃上清,每孔加入DMSO150μL振荡使结晶溶解,并在全自动酶标仪上测定各孔490 nm区的吸光度(A)值,并计算细胞增殖率,细胞增殖率=实验组A值/对照组A值×100%。

将1×10⁵个细胞接种于25cm²培养瓶中,培养24 h待细胞贴壁,加入不同浓度DHA的培养液(药物终浓度分别为0、0.05、0.50、5.00和50.00μmol·L^-1),其中0μmol·L^-1为空白对照组,培养24 h后倒置显微镜下观察并拍照。

分别用0、0.05、0.50、5.00和50.00μmol·L^-1 DHA处理SH-SY5Y细胞24 h后,胰酶消化细胞,PBS洗涤细胞,离心后苔盼蓝计数活细胞。80%冷甲醇10mL固定,-20℃放置过夜。次日,以1000 r·min^-1 速度离心5 min,弃上清,PBS洗涤细胞,调整细胞密度为1×10⁷mL^-1。取100μL细胞悬液至流式管内,加入PI染液混匀,避光孵育30 min,300目尼龙筛网过滤,上机检测。

用含不同浓度DHA的培养液(药物终浓度分别为 0、0.05、0.50、5.00和50.00μmol·L^-1)作用于SH-SY5Y细胞24h。收集培养上清,与包被液按1∶1比例包被后4℃过夜。封闭后分别加入cyclin D1及caspase-3抗体(1∶1000稀释)4℃过夜。加入二抗(1∶1000稀释)37℃下孵育1.5h,室温避光显色,颜色呈棕黄色变化时终止显色。自动酶标仪492nm处测定吸光度(A)值,以A值表示cyclinD1和caspase-3的表达水平。

将SH-SY5Y细胞以1×10⁵mL^-1 接种于25cm²培养瓶中。加入含0、0.05、0.50、5.00和50.00μmol·L^-1DHA的培养液作用24 h。收集细胞,PBS洗涤细胞,80μL细胞裂解液充分裂解细胞,12000 r·min^-1、4℃离心15min,留上清,测定上清样品的蛋白浓度,SDS-PAGE跑胶分离样品,转膜封闭,加入β-actin、cyclin D1和caspase-3抗体,4℃孵育过夜。二抗室温孵育1h,胶片曝光拍照。结果采用Image-Pro Plus图像分析管理系统分析,以特异性条带平均A值与面积的乘积为有效值,表示蛋白表达的水平。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。各组细胞增殖率、细胞凋亡和细胞周期、cyclin D1及caspase-3表达水平以x[TX-]±s表示,组间均数采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

MTT结果显示:不同浓度的DHA作用SH-SY5Y细胞24、48和72h时,均可抑制细胞的生长;0.50、5.00和50.00μmol·L^-1DHA组SH-SY5Y细胞增殖率明显下降,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。DHA对SH-SY5Y细胞的作用呈现剂量依赖效应。当DHA作用24h时对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用最明显,因此选取24 h作为后续实验的时间。见表 1。

倒置显微镜下观察:与空白对照组比较,各浓度DHA组培养瓶内贴壁细胞的数量均明显减少,并且随着药物浓度的升高,细胞密度呈下降的趋势。见图 1。

图1 倒置显微镜观察DHA作用后SH-SY5Y细胞的生长(×200) Fig.1 Growth of SH-SY5Y after treated with DHA observed by inverted microscope (×200) A:Blank control group; B:50.00 μmol·L-1 DHA group.

图选项

流式细胞术检测结果显示:随着DHA浓度的增加,SubG₁期细胞的比例增加。与对照组比较,50.00 μmol·L^-1 DHA组SubG₁期细胞的比例明显升高(P＜0.05)。G₀/G₁期细胞比例先升高再降低,S期与G₂ /M期细胞比例降低。见表 2。

ELISA法检测结果显示:各浓度DHA组细胞培养上清中cyclinD1蛋白表达水平减少,与空白对照组比较,50.00μmol·L^-1DHA组cyclinD1表达水平明显减少(P<0.05)。与空白对照组比较,DHA组caspase-3蛋白表达水平升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。

Western blotting检测结果显示:DHA组SH-SY5Y细胞中cyclin D1蛋白表达水平降低,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。DHA组caspase-3蛋白表达水平升高,与空白对照组比较,50.00 μmol·L^-1DHA组差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 2。

图2 DHA作用后各组SH-SY5Y细胞中cyclin D1和caspase-3蛋白表达 Fig.2 Expressions of cyclin D1 and caspase-3 proteins in SH-SY5Y cells after treated with DHAin various groups Lane 1-5:0,0.05,0.50,5.00,and 50.00 μmol·L-1 DHA groups; *P<0.05,**P<0.01 vs 0 μmol·L-1 group.

图选项

青蒿素(artemisinin)是从菊花科植物黄花蒿中提取的一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物,在临床上治疗脑型疟疾和恶性疟疾具有显著疗效。DHA是青蒿素在体内主要的活性代谢产物,其口服生物利用度可高于青蒿素10倍以上,抗疟疾作用是青蒿素的4~8倍。除抗疟疾外,DHA还具有明显的抗肿瘤功能^{[4, 5, 6, 7]}。但有关DHA抑制SH-SY5Y细胞生长的作用尚不明确。

本实验首先研究了不同浓度DHA对SH-SY5Y细胞生长的影响。MTT结果显示:不同浓度DHA在不同时间内均可以明显地抑制SH-SY5Y细胞的生长,药物的抑制作用具有明显的浓度依赖效应。在倒置显微镜下观察用药后细胞生长状态:各用药组细胞的密度均随着药物浓度的升高而明显降低。以上结果说明:DHA呈浓度依赖性地抑制SH-SY5Y细胞的生长。

本研究应用流式细胞术检测不同浓度DHA作用于SH-SY5Y细胞的细胞周期时显示:随着DHA浓度的增加,SubG₁期细胞的百分比增加,G₀/G₁期细胞百分比先升高再降低、S期与G₂/M期细胞百分比减少。众所周知,细胞的生长受细胞周期蛋白(cyclins)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的调控,其中细胞周期蛋白中cyclin D1对细胞的生长起着正向的调节作用^[7]。研究^{[8, 9]}表明:DHA可以将细胞周期阻滞于G₀/G₁期,并使G₁/S交界处的转换出现问题。而cyclin D1是G₁/S交界处转换的关键蛋白,阻断或敲除cyclin D1基因可使细胞阻滞于G₀/G₁期,从而使细胞更易发生凋亡^{[10, 11, 12]}。因此,DHA有可能通过下调cyclin D1蛋白的表达,使细胞周期无法向S期转变,从而阻滞细胞周期,抑制细胞的生长。因此,本实验中DHA作用后SH-SY5Y细胞分泌及表达cyclin D1蛋白水平均下降,这恰好验证了本文作者的猜想是正确的,即DHA通过调控cyclin D1蛋白来抑制细胞的生长。

细胞凋亡是指由多种基因控制的细胞程序性死亡的过程,并由一系列胞内蛋白水解酶的活化和功能发挥作用所致,其中caspase家族在细胞凋亡过程中起着重要作用^[13]。虽然caspase在大多数的肿瘤组织中表达量极少^[14],但却是caspase级联反应的必经之路,也是细胞凋亡过程中关键的执行分子。casepase-3以酶原的形式存在于胞浆中,发生细胞凋亡时其被激活而使肿瘤细胞发生凋亡^[15]。研究^[16]表明:DHA诱导细胞凋亡可能与激活caspase通路有关。本实验结果显示:DHA作用后细胞分泌和表达caspase-3蛋白的水平增加,这也验证了DHA可以激活caspase-3而诱导凋亡的发生。

综上所述,DHA可能是通过下调细胞周期蛋白cyclin D1及激活caspase-3诱导肿瘤细胞发生凋亡,从而达到抑制神经母细胞瘤细胞生长的作用。但影响肿瘤细胞生长的因素有很多,本实验中有关细胞周期调控和凋亡通路的激活只是进行了初步的研究,有关DHA抗肿瘤的作用机制还需要更深入的探讨。