乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,居女性癌症死因前列^[1]。近期研究^[2]表明:Hedgehog通路与乳腺癌有密切关联,Hedgehog过表达促进乳腺癌的增殖及转移,是一个独立的不良预后因子,但其具体作用机制仍未完全清楚。环巴胺(cyclopamine) 是20世纪60年代从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱,为Hedgehog信号通路的阻断剂^[5]。本实验通过研究环巴胺对乳腺癌细胞系MCF-7的体外生长抑制效应,以及其对细胞凋亡与间隙连接蛋白32(connexin 32,Cx32)和间隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)胞膜表达的影响,初步探讨Hedgehog通路在乳腺癌细胞增殖和转移中的作用机制。

MCF-7细胞购自中国医学科学院肿瘤医院细胞库。环巴胺购自美国Biomol公司,MEM细胞培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司,胰蛋白酶、MTS和DMSO购自美国Sigma公司,AnnexiⅤ-FITC/PI试剂盒购自凯基公司,FITC标记CX43及Cx32单抗购自上海信然公司。

MCF-7细胞培养于含10% FBS、100 U·mL^-1 青霉素、100 IU · mL^-1链霉素MEM培养基中,细胞置于37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。待细胞融合度达80%~90%后,用0.2%含EDTA胰酶消化,1∶3传代培养,每3~4 d传代1次。

取对数生长期的MCF-7细胞,调整细胞浓度约为5×10⁴ mL^-1,接种于96孔板中,每孔加100μL细胞悬液(约5×10³个细胞)。每组设3个复孔,置37℃、5％ CO₂条件下培养。24 h后,弃各孔内培养基,加入含不同浓度环巴胺培养基,浓度为0(空白对照)、5、10、20、30和40 μmol ·L^-1。分别继续培养24、48和72h后,加入MTS (5 g·L^-1)溶液,20 μL/孔,37℃继续孵育4 h后,小心吸弃各孔内的培养上清液,加入0.5 g·L^-1 DMSO(同时设无细胞DMSO组),100 μL/孔,在水平摇床上振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪492 nm 波长处测定各孔的吸光度(A)值,取平行对照孔均值,计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率 =1 -(实验组A值-DMSO组A值)/(空白对照组A值-DMSO组 A值)×100%。

取环巴胺对MCF-7细胞48 h的半数致死量25μmol· L^-1为作用浓度,Annexin Ⅴ-FITC、PI双标记染色流式细胞仪检测环巴胺对MCF-7细胞作用48 h的凋亡效应,并计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/检测细胞总数×100%。

细胞生长至对数期,0.2%胰酶消化至单细胞悬液,计数细胞,按每孔2 mL(约5 × 10⁵个细胞)将细胞接种于6孔板,培养24 h后,弃去原培养基,加入含不同浓度环巴胺的培养基,浓度分别为0(阴性对照组)和25μmol·L^-1,各组设3个复孔。于药物处理48 h后,刮除细胞并收集;0.1 mol·L^-1 PBS洗涤细胞2次(1000 r·min^-1离心10 min);分别加入100μL 1∶100 FITC-Cx32稀释液;4℃、避光孵育1 h后加入 0.1 mol·L^-1 PBS300 μL,混匀,流式细胞仪检测。Cx43检测过程同上。

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析。各组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率和胞膜CX32及CX43阳性表达率均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

与空白对照组比较,当环巴胺浓度达10 μmol·L^-1或以上时,细胞增殖率明显下降(P<0.05)。环巴胺组MCF-7细胞经10、20、30和40 μmol·L^-1环巴胺作用24h后,增殖抑制率分别为(14.85±1.77)%、(32.04±3.15)%、(52.87±3.59)%、(71.18±3.00)%;48h后分别为(31.03±6.09)%、(47.11±3.69)%、(62.76±1.93)%、(76.08±3.69)%;72h后分别为(51.68±4.47)%、(66.04±2.85)%、(76.08±3.04)%、(76.08±3.04)%。环巴胺对MCF-7细胞增殖抑制作用随剂量增加和作用时间延长而增强,表明环巴胺对MCF-7细胞增殖的抑制作用具有浓度、时间依赖性。见图 1。

图1 环巴胺作用不同时间各组MCF-7细胞增殖抑制率 Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of MCF-7 cells at different time after treated with cyclopamine in various groups

图选项

经25μmol·L^-1环巴胺作用于MCF-7细胞48 h后,细胞凋亡率为(13.88±2.56)%,明显高于空白对照组(3.44％±0.23%)(P<0.05),表明环巴胺抑制细胞增殖可能是通过促进MCF-7细胞发生凋亡所致。

环巴胺可使MCF-7细胞Cx32及Cx43胞膜表达增加。25 μmol·L^-1环巴胺组MCF-7细胞经作用48 h后,胞膜Cx32和Cx43阳性表达率均明显高于阴性对照组(P<0.05)。见表 1。

Hedgehog通路最初发现于果蝇,并在脊椎动物中高度保守,是胚胎发育过程中的一个重要调节因子^[6]。该通路在无配体存在时,跨膜信号受体Ptch抑制SMOH的活性,导致GLI磷酸化后被蛋白酶体降解而无法发挥生物学效应;当Hh配体存在时,通过其与Ptch结合,解除对SMOH活性抑制,GLI从SMOH蛋白复合体中释放,并转移至核内,导致Hedgehog通路下游相关基因的转录激活。近期研究^[2]表明:Hedgehog通路与乳腺癌关系密切,是乳腺癌干细胞的重要通路;其激活后可促进乳腺癌的表皮间质转化及转移^[7];而且雌激素还可通过激活Gli1增强雌激素受体阳性乳腺癌的干细胞特性及侵袭性^[3]。Hedgehog通路过度激活与乳腺癌生存期短有关^[4]。

本研究以乳腺癌细胞系MCF-7作为研究对象,应用环巴胺阻断Hedgehog信号通路,观察其对细胞增殖的影响。本研究结果显示:环巴胺可抑制MCF-7细胞的增殖、促进其细胞凋亡,提示 Hedgehog通路影响MCF-7细胞增殖与抑制凋亡有关。

间隙连接蛋白(connexins,Cx)是缝隙连接的基本组成单位。Cx可通过缝隙连接介导的细胞间通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)、半通道介导的细胞间通讯或与胞内蛋白交互联系等方式发挥作用^[8]。其中,GJIC是相邻细胞间信号传导的重要途径,对维持组织中细胞群的代谢和生长的均衡性和协调性至关重要,肿瘤组织中Cx胞膜表达往往减少,GJIC功能减弱,从而影响肿瘤的生物学行为。

Cx与乳腺癌细胞的侵袭与转移有密切关联,体外实验及动物模型研究^{[9, 10, 11, 12]}均显示:Cx可抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭,从而减少乳腺癌肺转移。乳腺癌原发灶Cx的表达还与HER-2状态及Ki-67指数呈负相关关系,新辅助化疗前Cx高表达的乳腺癌患者总生存期更长,是乳腺癌的一种重要的预后指标^[13]。但一旦发生转移,循环肿瘤细胞的Cx可能会促进转移细胞在转移灶的黏附与定植,如淋巴结转移^[14]、肺转移^[15]及脑转移^[16],提示Cx在乳腺癌原发灶与转移灶作用的异质性。

以往研究^[8]证实:Cx及Hedgehog通路之间存在关联,二者在胚胎发育过程中具有协同作用。为进一步探索Hedgehog通路对乳腺癌细胞的作用机制,本研究应用流式细胞术检测了Hedgehog通路阻断前后MCF-7细胞胞膜Cx32和Cx43的变化。本研究结果显示:阻断Hedgehog通路可增加Cx43及Cx32胞膜表达,表明Hedgehog通路可通过调节乳腺癌细胞Cx43及Cx32的胞膜表达影响 GIJC功能,改变细胞间制约作用,Hedgehog促进乳腺癌转移可能与Cx32和Cx34过表达有关。

综上所述,Hedgehog通路可抑制乳腺癌细胞凋亡,并调节Cx43及Cx32的胞膜表达。