细胞分裂周期25B(Cdc25B)在小鼠卵母细胞由前期Ⅰ向中期Ⅰ过度中起着启动者的作用^[1]。14-3-3蛋白是一个非常保守的酸性调节蛋白家族^[2]，从酵母到哺乳动物的所有真核细胞中均表达14-3-3蛋白。 14-3-3蛋白对细胞周期的调控作用是目前的研究热点，例如，14-3-3蛋白在体细胞中控制Cdc25B的细胞定位^[3]。 近年来，有关14-3-3蛋白通过Cdc25B磷酸酶调控细胞周期进程的报道^{[4, 5]}日益增多。但是在小鼠卵母细胞中14-3-3蛋白是否通过Cdc25B磷酸酶调控小鼠卵母细胞停滞于生发泡(germinal vesicle，GV)期目前国内外未见报道。本研究将构建的14-3-3ε和Cdc25B(包括突变体)的质粒在体外转录成mRNA,显微共注射到GV期小鼠卵母细胞中，探讨14-3-3ε和Cdc25B对小鼠GV期卵母细胞减数分裂的影响，为揭示小鼠卵母细胞发育的分子机制提供实验依据。

表达载体pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321A和pcDNA3.1-MYC-Cdc25B- S321D由本实验室构建并保存。mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit 体外转录试剂盒(Ambion 公司，美国)，CDC2-pTyr15 抗体、CDC25B 一抗(E-19)、β-actin抗体 (Santa Cruz 公司，美国)，HRP 标记的兔抗山羊IgG 、HRP 标记的山羊抗兔IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司)，ECL化学发光试剂盒(Piece Biotechnology 公司，美国)，预染蛋白Marker(MBI 公司，美国)，M2培养液(Sigma公司，美国)，二丁酰环一磷酸腺苷(dbcAMP)(Sigma公司，美国)，Waymouth MB752／1培养液(Invitrogen)和[γ-³²P]三磷酸腺苷(北京福瑞公司)，其余试剂(Sigma 公司，美国)。低温超速离心机(Sigma公司，美国)，台式高速离心机(TGL-16B，上海安亭科学仪器厂)，凝胶自动成像仪GDS8000(BIO-RAD公司，美国)，紫外分光光度仪(Phannacia公司，美国)，细菌培养箱、空气浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂)，实体显微镜SZ12型(Olympus公司，日本)，相差显微镜OPTIPHOT/DIC型(Nikon公司，日本)，显微操作系统(Eppendorf Tramferman，英国)，日本Ⅸ-70倒置显微镜，CO₂培养箱CBll5(WTB-binder，德国)，BECKMAN液闪计数仪(德国)。

3～4周龄昆明种雌性白鼠，腹腔注射10IU孕马血清(PMSG)，自由采食与饮水，48h后颈椎脱臼法处死，剖开腹腔取出卵巢，放于含有125μmol·L^-1 二丁酰环一磷酸腺苷(bucladesine，dbcAMP)的M2培养液中，在体视显微镜下用1mL注射器针头剔除卵巢周围脂肪及结缔组织，刺破大的有腔卵泡，轻压后释放出卵丘卵母细胞复合物(cumulus-oocyte complex，CEOs)及天然裸卵母细胞，用口径略大于卵母细胞直径的捡卵管反复吹打去除附着的颗粒细胞，获得含完整GV的裸卵母细胞，在M2培养液中洗3次，分为非dbcAMP处理组和dbcAMP处理组，前者卵母细胞在接受不同注射后，在MB培养液(在Waymouth MB752/1培养液的基础上添加100 mg·L^-1丙酮酸钠、0.05 U·L^-1青霉素和50 mg·L^-1链霉素，3 g·L^-1BSA，此培养液简称为MB培养液)中洗3次后转入12孔培养板，每孔加入200μL预先在培养箱中平衡2h的MB培养液，上覆矿物油，放入接受相同注射的卵母细胞，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内培养。dbcAMP处理组卵母细胞接受注射后，转移到添加200μmol·L^-1 dbcAMP的MB培养液中，培养条件同上。

①模板制备： 分别取1μg pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、pcDNA3.1-Myc- Cdc25B-WT、 pcDNA3.1-Myc-Cdc25B-S321A和 pcDNA3.1-Myc- Cdc25B-S321D，经XbaⅠ酶切线性化后用于体外转录。酶切反应体系为20μL (质粒1μg，10×Y⁺/Tanqo(with BSA) 2μL,XbaⅠ 10U,补水至20μL。37℃酶切3 h，65℃灭活20 min。然后去RNA酶和转录抑制剂，加入SDS及蛋白酶K，50℃反应30 min，酚：氯仿抽提，12000 r·min^-1离心2 min，转移上层水相至1个新试管中，以3mol·L^-1醋酸钠(pH5.2)及无水乙醇沉淀，12000 r·min^-1离心10min，弃上清，加入不含RNA酶的去离子水溶解，作为体外转录的模板。②体外转录：应用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit)将制备好的线性模板体外转录成带帽mRNA。37℃反应1h，然后用2U TURBO DNase于37℃反应15min消化DNA模板。37℃反应40min后，置于冰上加Poly(A)尾。③RNA纯化：用酚、氯仿抽提纯化mRNA，最后加入氯化锂沉淀mRNA，12000 r·min^-1在4℃离心15 min，弃上清，70％乙醇洗涤后溶解于无核酸酶污染的5 mmol· L^-1Tris和0.5 mmol·L^-1乙二胺四乙酸(EDTA，pH7.4)中，用于显微注射。通过测定mRNA在260nm的吸光度(A)来定量mRNA。

显微注射应用倒置显微镜显微操作系统。将GV期卵母细胞移入到含有125 μmol·L^-1 dbcAMP的 M2液滴中，用持卵针将卵母细胞固定，将注射针吸好一定量的 mRNA刺入细胞将样品注入胞浆，为尽量减少显微注射对卵母细胞的影响，一般注入到卵母细胞内的样品体积为10 pL (相当于其总体积的5％)。对照组为注射TE缓冲液组。注射后放入含有200 μmol·L^-1 dbcAMP 的MB培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内培养。实验组分为未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA＋Cdc25B(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA＋Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型) mRNA共注射组。

生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)率并照相 mRNA注射组和对照组细胞在MB培养液中培养，注射后在指定的时间点使用解剖显微镜来观察GVBD率，并使用相差显微镜观察卵的形态学。实验重复3～4次。

收集小鼠各注射组卵母细胞各200个，转移到1.5 mL Eppendof管中，4℃、3000 r·min^-1离心10 min，尽量去除培养液，加入适量RIPA裂解缓冲液，充分振荡混匀，然后经3～4次冻融循环，迫使卵母细胞裂解，置于-20℃备用。电泳前，加入SDS样品缓冲液，100℃煮沸5 min，离心后上样，12％SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST(pH7.4)将硝酸纤维素膜于室温摇动温育1h进行封闭，封闭后的硝酸纤维素膜再与HA抗体(稀释比为1：800)或MYC抗体(稀释比为1：1000)4℃温育过夜。经TBST洗涤后，辣根过氧化物酶偶联的IgG作为二抗(稀释比为1：5000)室温温育2h，洗膜后，使用ECL发光法显色。

根据实验需要收集不同时期MB培养液中的小鼠卵母细胞各5个，转移到含有5 μL收集液的Eppendorf管中，随后立即置－70℃速冻保存直至检测活性前。收集液成分为含有1 mg·L^-1聚乙烯醇、5 mmol·L^-1 EDTA、10 mmol·L^-1Na₃VO₄和10 mmol·L^-1 NaF的磷酸盐缓冲液(pH7.4)。将收集的卵母细胞反复冻融3 次，使细胞裂解，加入MPF 反应液25μL，置30℃水浴反应7 min。取25μL点在Whatman P81 强阳离子交换滤纸(1cm×2cm)上，以75 mmol·L^-1 磷酸溶液反复洗3次终止反应，最后将滤纸置于含10 mL 蒸馏水的液闪瓶内，用Beckman 液闪计数仪测定cpm 值。实验重复3～4次。

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。小鼠卵母细胞GVBD率、MPF活性、第2次减数分裂中期(MII)和卵母细胞死亡率以 x±s 表示，2组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

注射后，卵母细胞转移到含有200 μmol·L^-1 dbcAMP MB培养基培养。1h后观察。未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3ε mRNA单独注射组、14-3-3ε mRNA+Cdc25B-WTmRNA共注射组和14-3-3ε mRNA +Cdc25B-S321D mRNA共注射组在20h后均未发生GVBD，注射组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。14-3-3ε mRNA+Cdc25B-S321A mRNA共注射组在注射后1、2和3h的GVBD 率分别为(5.00±0.68)%、(62.00± 3.56)%和(100.00±0.00)%，在注射20h后有(79.00±2.80)%的卵母细胞到达MII，与未注射组比较差异有统计学意义 (P<0.01)。 见表 1。

各注射组在注射后，每间隔1 h取一定数量卵母细胞检测MPF活性。未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3ε mRNA单独注射组、14-3-3ε mRNA+Cdc25B-WT mRNA共注射组和14-3-3ε mRNA +Cdc25B-S321D mRNA共注射组MPF活性在20 h内一直处于较低水平；而HA-14-3-3ε mRNA+Cdc25B-S321A mRNA共注射组MPF活性在20 h内呈现周期性变化，在GV期很低，然后逐渐升高，在第1次减数分裂中期(MI)达到第1次峰值，随后迅速降入低谷，到MII又达到第2个峰值，并在此维持数小时，MPF活性与其他注射组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图 1。

图1 显微注射后不同时间各组H1激酶活性 Fig.1 H1 kinase activities in various groupsat different time after microinjection

图选项

TE缓冲液注射组、14-3-3ε mRNA单独注射组、14-3-3ε mRNA+Cdc25B-WT mRNA共注射组和14-3-3ε mRNA+Cdc25B-S321D mRNA共注射组Cdc2-Tyr15处于磷酸化状态，而14-3-3ε mRNA+Cdc25B-S321A mRNA共注射组注射后3 h只检测到微弱的磷酸化的Cdc2-Tyr15。见图 2。

图2 各注射组在注射3 h后卵母细胞Cdc2-Tyr15磷酸化状态电泳图 Fig.2 Electrophoregram of phosphorylation status of Cdc2-Tyr15 in mouse oocytes in various groups 3 h after injectoin in various groups

图选项

在MB培养液含200 μmol·L^-1 dbcAMP持续激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的条件下，卵母细胞显微注射Cdc25B各种mRNA 3 h后，与TE注射组比较，各Cdc25B mRNA注射组Cdc25B蛋白呈现高水平表达(图 3)，表明显微注射的各种Cdc25B mRNA均能在小鼠卵母细胞内被有效翻译成Cdc25B蛋白。

图3 显微注射mRNA 3 h后各组Cdc25B蛋白表达电泳图 Fig.3 Electrophoregram of expressions of Cdc25B protein 3 h after microinjection of Cdc25B mRNAs in various groups

图选项

在MB培养液含200 μmol·L^-1 dbcAMP持续激活PKA的条件下，卵母细胞显微注射14-3-3ε mRNA 3 h后，与TE注射组比较，14-3-3ε蛋白呈现高水平表达(图 4)，表明各组显微注射的14-3-3ε mRNA均能在小鼠卵母细胞内被有效翻译成HA-14-3-3ε蛋白。

图4 显微注射HA-14-3-3ε mRNA 3h后各组HA-14-3-3ε蛋白表达电泳图 Fig.4 Electrophoregram of expressions of HA-14-3-3ε protein 3h after microinjection of HA-14-3-3ε mRNAs in various groups

图选项

对爪蟾卵母细胞的研究^{[6, 7, 8]}表明：在GV期阻滞的卵母细胞中，减数分裂的启动子MPF的催化亚基Cdc2-Thr14/Tyr15被磷酸化，MPF活性受到抑制，PKA可直接磷酸化Cdc25C的287位丝氨酸，此位点磷酸化后导致14-3-3蛋白的结合，Cdc25C被隔离于细胞质活性受抑，不能进入核内使Cdc2的Thr14/Tyr15脱磷酸，因而不能激活MPF,卵母细胞发生GV期阻滞。小鼠卵母细胞的研究^{[9, 10, 11, 12, 13]}证实：PKA 通过Cdc25B 的321 位丝氨酸磷酸化修饰引起GV 期阻滞，PKA/Cdc25B 通路在小鼠卵母细胞减数分裂中发挥重要作用，Cdc25B 能促进减数分裂的重新启动，其突变体(S321A)能完全解除PKA 引起的GV 期阻滞，而突变体(S149A)却不能解除GV 期阻滞。但是在小鼠卵母细胞发育过程中14-3-3是否参与了Cdc25B对小鼠卵母细胞GV期阻滞未见报道。 Uchida等^[14]的实验结果显示：在HEK293细胞中14-3-3ε能与Cdc25B的309位丝氨酸结合并且控制Cdc25B的细胞质定位。本研究构建了pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε真核表达载体，在体外转录成mRNA,通过显微注射于GV期小鼠卵母细胞，以期观测14-3-3ε和Cdc25B(野生型、突变性)的过表达对GV期卵母细胞及Cdc2-Tyr15磷酸化状态的影响。本研究结果表明:单独过表达14-3-3ε对GVBD率无影响，同时共表达14-3-3ε和Cdc25B(野生型)、14-3-3ε和Cdc25B-S321D(模拟磷酸化)同样不能提高GVBD率，而共注射14-3-3ε和Cdc25B-S321A却能提高小鼠卵母细胞的GVBD率,MPF活性呈现周期性变化,表明Cdc25B-S321A能更有力地诱导卵母细胞减数分裂的恢复。同时又检测了各注射组Cdc2-Tyr15磷酸化状态，其他注射组Cdc2-Tyr15是磷酸化的，只有14-3-3ε mRNA+Cdc25B-S321A mRNA共注射组检测到微弱的磷酸化信号，说明MPF被激活。结合以前的研究发现：在小鼠GV期卵母细胞中，Cdc25B-S321是磷酸化的，在GVBD后是脱磷酸化的，通过本研究进一步证明本文作者的假设: 在小鼠卵母细胞中,PKA使Cdc25B-S321磷酸化，磷酸化的321位丝氨酸与14-3-3ε结合，卵母细胞停滞于GV期，在某种磷酸酶的作用下，Cdc25B-S321脱磷酸而不能与14-3-3ε结合，Cdc25B入核激活MPF，小鼠卵母细胞恢复减数分裂。

综上所述，本研究初步证明了小鼠卵母细胞中14-3-3ε是通过Cdc25B的321位丝氨酸实现对卵母细胞发育的调控作用。最近本课题组^[15]通过质谱分析证实PKA在体外能磷酸化小鼠Cdc25B的321位丝氨酸，即Cdc25B是PKA的直接作用底物。张阳等^[11]也证实：野生型Cdc25B定位于GV期小鼠卵母细胞的细胞质，而Cdc25B-S321A定位于细胞核。那么14-3-3ε和Cdc25B-S321是否能结合呢? 为了证明GV期卵母细胞中14-3-3ε和Cdc25B-S321的结合，下一步将进行免疫共沉淀实验，这也是本课题组要进一步深入研究的课题。