重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是主要累及神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)处突触后膜乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor protein,AchR)、突触前膜受体和兰尼碱受体等病变引起的以全身或部分骨骼肌易疲劳无力为主要症状的获得性自身免疫性疾病^[1]。MG主要由乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导，多种相关抗体参与 ^[2]，导致突触后膜的破坏以及AchR减少，致肌间神经传导受阻，出现肌无力表现^[3]。骨骼肌AchR在大部分情况下是自身免疫攻击靶点^[4]。常规的西医治疗效果并不理想，常常出现病情反复的情况。针刺治疗MG 在缓解症状、改善患者生活质量、降低西药不良反应、提高机体免疫力等方面均有一定的作用^[5]。MG被许多医家归结为“痿证”范畴，其主要病机可归纳为脾气虚弱、肾阳不足。本文作者采用“温阳补气”为治疗原则的针刺与艾灸相结合的疗法治疗实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)取得了良好的效果。为更深入研究“温阳补气”针法治疗EAMG的作用机制和治疗效果，本研究采用Western blotting法检测“温阳补气”针法对EAMG大鼠NMJ处AchR蛋白表达的影响，探索性地将该针法应用到国际公认的EAMG大鼠模型治疗中，观察其对腓肠肌NMJ处AchR蛋白表达水平的影响。

SPF级雌性Lewis大鼠70只，7～8周龄，体质量150~160g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。检疫合格后，送至吉林大学基础医学院动物实验中心大鼠隔离环境动物饲养室，由专门的饲养员饲养。 AchR α1 129-145多肽片段(吉尔生化上海有限公司)，Trizol(美国Invitrogen 公司)，GAPDH兔抗大鼠一抗、CHRNA1(AchR兔抗大鼠一抗 )、HRP标记山羊抗兔二抗 (武汉博士德公司)，溴吡斯的明(上海中西三维药业有限公司)。针灸针(贵州安迪药械有限公司，0.25mm×25 mm)，艾条 (南阳市卧龙汉医艾绒厂，18 mm×20 mm,10支)。

采用主动免疫法，选取60只大鼠建立EAMG大鼠模型，将AchR α1 129-145多肽片段以1∶2的比例与完全弗氏佐剂(CFA)(第1和2次)、不完全弗氏佐剂(IFA)(第3次)完全乳化，按200 μL溶液内含有50 μg片段配伍。用pH7.4的PBS缓冲液将不足部分定溶，当乳化剂滴入冷水时，保持完整不分散、浮于水面时为合格的油包水剂。实验过程均在超净工作台中进行，3次免疫间隔时间为4周，接种方式为皮下注射。抗原乳剂以 200 μL/只注射于大鼠背部6点(20 μL/点 )、两后足垫处(各20 μL)、尾根部(40 μL)。当Lennon症状分级评分^[6]≥1分、同时大鼠尾根血血清检测AchR-Ab阳性，则判定模型复制成功^[7]。

将建模成功的EAMG大鼠中随机选取30只，分为模型对照组10只、药物对照组(溴吡斯的明)10只和针刺治疗组(“温阳补气”针法)10只，将同一批购进的未建模的10只大鼠作为空白对照组。药物对照组根据《药理实验方法学》^[8] 给予EAMG大鼠溴吡斯的明18.5 mg·kg^-1灌胃；针刺治疗组予以“温阳补气”针法治疗：选取手三里(双) 直刺5 mm，足三里(双) 、脾俞(双)、肾俞(双)穴均直刺6 mm，针刺后行平补平泻手法，使针下沉紧，操作结束后针上加约1cm艾柱，连灸3壮，并留针 30 min，以上2组治疗均为每天1次，7 d为1个疗程 ，共治疗2疗程，疗程间休息1d。空白对照组和模型对照组大鼠仅做对照观察，不予任何特殊处置。

治疗结束后，取大鼠下肢腓肠肌NMJ处周围组织，放在滤纸上，称质量，加0.1 mL·100 mg^-1TRizol液，采用匀浆器搅拌，放入冻存管后放入－80℃保存。提取RNA后剩余部分加入1.5 mL 异丙醇，室温静置10 min，4℃、12000 g离心10 min以沉淀蛋白质。弃去上清，用0.3 mol·L^-1盐酸胍溶液洗涤3次蛋白质沉淀。1 mL TRIzol试剂添加2 mL洗涤液。每次洗涤后，室温静置20 min，4℃、7500 g离心5 min。清洗后，加入2 mL乙醇，混匀蛋白沉淀。室温静置20 min，4℃、7500 g离心5 min。真空干燥10 min，加入微量1％SDS吹打溶解蛋白沉淀，50℃孵育样品2 min，4℃、10000 g离心10 min，转移上清。采用Western blotting法测定大鼠NMJ处AchR蛋白表达水平，检测结果采用目的蛋白与内参蛋白之比的R值表示，具体步骤按说明书操作。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。大鼠腓肠肌NMJ处AchR蛋白表达水平以x±s表示，组间差异比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

从首次免疫接种后第4周开始大鼠逐渐出现活动减少、体质量减轻、抓握力量减小等症状。实验过程中，6只大鼠因症状过重而死亡。存活54只免疫大鼠中有32只大鼠Lennon分级评分≥1分，且ELISA法检测血清AchR-Ab阳性。本实验建模成功大鼠共32只。

与空白对照组比较，建模成功后治疗前模型对照组、药物对照组和针刺治疗组大鼠Lennon症状评分明显升高(P<0.01)。与模型对照组比较，经过2个疗程治疗后药物对照组和针刺治疗组大鼠Lennon症状评分明显降低(P<0.01)。见表 1。

与模型对照组比较，治疗后针刺治疗组和药物对照组大鼠腓肠肌NMJ处AchR 蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。药物对照组与针刺治疗组大鼠AchR 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图 1和表 2。

Lane 1:Blank control group;Lane 2:Model control group; Lane 3:Drug control group; Lane 4:Acupunctrure treatment group. 图1 Western blotting法检测各组大鼠腓肠肌NMJ处AchR蛋白表达 Fig.1 Expressions of AchR protein in gastrocnemius NMJ of rats in various groups detected with Western blotting method

图选项

MG产生的主要原因是AchR-Ab与NMJ处突触后膜的AchR特异性结合，加速AchR降解，导致突触后膜上AchR数量减少，从而阻碍了神经电 信号传导^{[9, 10]}。研究 ^[11] 显示：中国人51.2%~66.0%全身型及眼肌型MG患者血清中均可测出AchR-Ab。AchR主要集中于神经细胞和肌细胞之间的突触，是由2个α和β、γ、δ亚单位各1个组成的五聚体，α亚单位不仅参与抗体的结合，还直接与ACh结合，对该位点研究能阐明MG特异性病因机制。与AchR α亚单位直接作用的致病抗体能与AchR之间产生某种交叉联系，使含有AchR的膜成分降解，使AchR半减期缩短，造成突触后膜AchR数量减少，导致终板功能障碍。本研究也显示肌肉烟碱型AchR α1亚基蛋白在EAMG大鼠腓肠肌NMJ处表达均降低，说明AchR蛋白在EAMG的发病过程中发挥着重要的作用。

国内多数医家^{[12, 13, 14, 15, 16]}认为:脾和肾为MG的主要病变部位。脾胃为后天之本，气血生化之源，主管四肢肌肉的活动及营养；肾为先天之本，主藏精，主人体生长发育。脾气虚则肌肉失于气血津液之濡养，功能降低；肾阳虚则无以温煦蒸腾，肌肉骨骼失去津液之滋养，致肌肉痿软无力，故脾气虚弱，肾阳不足是重症肌无力的病机关键。“温阳补气”针法取“治痿独取阳明”之意，选取手阳明经之手三里、足阳明经之足三里，足三里还有益气养血、舒筋通络之功，是治疗虚劳及痿痹之要穴^{[17, 18]}；取“治脏病取俞穴”之意，选取脾俞、肾俞，有温补先、后天阳气，扶正祛邪之功效；针刺加以艾灸共同达到温阳强筋，补气助力的功效。研究^[19]显示：针刺有促进乙酰胆碱功能活动的作用。本课题组通过前期研究^[20]已证实：“温阳补气”针法通过调节NMJ处AchR表达水平而发挥治疗作用。本研究结果显示：“温阳补气”针法可以提高EAMG大鼠NMJ处突触后膜上AchR蛋白表达水平，促进神经电信号的传导，从而起到治疗EAMG的作用。