吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (02): 195-199

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郝兴霞, 张东泽, 于泊洋, 张岩, 周圆圆, 邱雪迎, 周好乐, 刘陶迪
HAO Xingxia, ZHANG Dongze, YU Boyang, ZHANG Yan, ZHOU Yuanyuan, QIU Xueying, ZHOU Haole, LIU Taodi
双酚A对成年雄性小鼠的生殖毒性及其作用机制
Reproductive toxicity of bisphenol A in adult male mice and mechanism
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(02): 195-199
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(02): 195-199
10.13481/j.1671-587x.20160201

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收稿日期: 2015-06-08
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郝兴霞, 张东泽, 于泊洋, 张岩, 周圆圆, 邱雪迎, 周好乐, 刘陶迪. 双酚A对成年雄性小鼠的生殖毒性及其作用机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(02): 195-199.
HAO Xingxia, ZHANG Dongze, YU Boyang, ZHANG Yan, ZHOU Yuanyuan, QIU Xueying, ZHOU Haole, LIU Taodi. Reproductive toxicity of bisphenol A in adult male mice and mechanism[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(02): 195-199.
双酚A对成年雄性小鼠的生殖毒性及其作用机制
郝兴霞1, 张东泽1, 于泊洋2, 张岩3, 周圆圆*, 邱雪迎Δ, 周好乐3 , 刘陶迪2     
1. 内蒙古医科大学形态学实验中心, 内蒙古呼和浩特 010110;
2. 内蒙古医科大学心身医学实验室, 内蒙古呼和浩特 010110;
3. 内蒙古医科大学遗传学教研室, 内蒙古呼和浩特 010110;
*内蒙古医科大学2012级法医专业;
Δ内蒙古医科大学2012级临床医学专业
收稿日期: 2015-06-08
基金项目: 国家自然科学基金资助课题(81260111);内蒙古自治区教育厅高等学校研究项目资助课题(NJZC13439);内蒙古医科大学“英才培育”项目资助课题(2014YCPY002)
作者简介: 郝兴霞(1981-),女,内蒙古自治区呼和浩特市人,医学硕士,主要从事生殖系统疾病发生机制方面的研究。
通信作者: 周好乐,教授,硕士研究生导师(Tel:0471-6653181,E-mail:zhl8416@126.com);
刘陶迪,教授,硕士研究生导师(Tel:0471-6657543,E-mail:1092027848@qq.com)
摘要: 目的: 探讨双酚A(BPA)对成年小鼠睾丸组织的损伤作用,阐明BPA对动物机体的生殖毒性及其作用机制。方法: 8周龄昆明小鼠40只随机分为对照组(玉米油)和低(100 mg·kg-1 BPA)、中(200 mg·kg-1BPA)、高(400 mg·kg-1BPA)剂量BPA组。灌胃染毒4周后,取小鼠睾丸组织,采用流式细胞术检测小鼠睾丸组织中细胞凋亡率;免疫组织化学法检测Fas和FADD蛋白表达情况。结果: 与对照组比较,低剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率、Fas和FADD阳性细胞表达率无明显变化(P>0.05);中和高剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率、Fas和FADD阳性细胞表达率明显升高(P<0.05)。与低剂量BPA组比较,中和高剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率、FAS和FADD阳性细胞表达率明显升高(P<0.05);与中剂量BPA组比较,高剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率、FAS和FADD阳性细胞表达率明显升高(P<0.05)。中剂量BPA组细胞凋亡率与FAS、FADD阳性细胞表达率呈正相关关系(r=0.430,P<0.05;r=0.238,P<0.01),高剂量组细胞凋亡率与Fas、FADD阳性细胞表达率呈正相关关系(r=0.637,P<0.01;r=0.359,P<0.01)。结论: 一定剂量BPA会导致小鼠睾丸组织中细胞凋亡率升高,凋亡调控基因Fas和FADD表达上调;BPA对小鼠睾丸组织有损伤作用,其生殖毒性与激活Fas死亡受体信号通路从而导致细胞过度凋亡有关。
关键词: 双酚A    Fas蛋白    FADD蛋白    细胞凋亡    
Reproductive toxicity of bisphenol A in adult male mice and mechanism
HAO Xingxia1, ZHANG Dongze1, YU Boyang2, ZHANG Yan3, ZHOU Yuanyuan*, QIU XueyingΔ, ZHOU Haole3, LIU Taodi2     
1. Experimental Centre of Morphological Practice, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China;
2. Psychosomatic Medicine Laboratory, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China;
3. Department of Genetics, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China
Abstract: Objective: To investigate the damage effect of bisphenol A (BPA) on the testis tissue of adult mice, and to reveal the reproductive toxicity of BPA in the body of animal and mechanism.Methods: 40 KM mice aged 8 weeks were randomly divided into control group (according to the weight ratio of corn oil gavage), low dose of BPA group (100 mg·kg-1 BPA), moderate dose of BPA group (200 mg·kg-1 BPA), and high dose of BPA group (400 mg·kg-1 BPA).4 weeks laster, the testis tissue was taken.The apoptotic rates in the testis tissue were detected by flow cytometry; the distribution and expression of Fas and FADD were measured by immunohistochemistry.Results: Compared with control group, the apoptotic rate, the expression rates of Fas and FADD in testis tissue of the mice in low dose of BAP group had no changes (P>0.05), while the apoptotic rates in the testis tissue and the positive expressions rates of Fas and FADD in moderate and high doses of BPA groups were increased (P<0.05). Compared with low dose of BPA group, the apoptotic rates and the positive expression rates of FAS and FADD in tests tissue of the mice in moderate and high doses of BPA groups were significantly increased(P<0.05). Compared with moderate dose of BPA group, the apoptotic rate and the positive expression rates of FAS and FADD in testis tissue of the mice in high dose of BPA group was significantly increased (P<0.05).The overexpression of Fas and FADD was positively correlated to the apoptotic rate in testis tissue in moderate dose of BPA group (r=0.430, P<0.05; r=0.238, P<0.01) and high dose of BPA group (r=0.637, P<0.01; r=0.359, P<0.01).Conclusion: BPA with content dose can increase the apoptotic rates of cells in testis tissue and the expressions of Fas and FADD.BPA's reproductive toxicity may be closely associated with the activation of Fas signal pathway and resulting in massive apoptosis.
Key words: bisphenol A    factor associated suicide    Fas-associated death domain    apoptosis    

双酚A(bisphenol A，BPA)已被证实是一种环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)。据统计，世界范围内每年产出超过360万吨，其中约100吨释放入大气中[1]。同时，生活中人们每天都可以接触到 BPA，如电子产品、运动器材、汽车、CD 光盘、DVD和复写纸等，这些聚碳酸酯塑料和环氧树脂产物在暴露于高温、酸、碱等环境中时，会释放溶出BPA，通过皮肤、消化道、呼吸道等途径进入人体[2, 3]。国内外研究[4, 5]已证明：BPA对动物机体有着潜在性、长期性的破坏作用，与很多系统疾病的发生有关。最新研究[6, 7, 8, 9]显示： BPA暴露能引起子代小鼠雄性比例增加;低剂量BPA会导致斑马鱼性早熟；胚胎发育过程中BPA会影响睾丸的发育；BPA易致胎儿先天发育缺陷。国内外有关BPA的生殖毒性研究大多集中在围产期BPA暴露对子代的影响及性激素的改变，而对于雄性成年期BPA暴露造成的睾丸组织内细胞的损伤研究较少。本研究利用不同剂量BPA染毒成年小鼠，探讨其对小鼠睾丸组织内细胞造成的损伤及其分子机制，从而为BPA的生殖毒性提供理论研究基础。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

雄性清洁级昆明(KM)小鼠40只，8周龄，体质量 30～33 g，由内蒙古大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(蒙)2002-0001，实验前适应性喂养 1 周。Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购于美国Sigma公司；自杀相关因子(factor associated suicide，Fas)和Fas相关死亡域蛋白(Fas-associated death domain，FADD)免疫组织化学试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司。石蜡切片机为莱卡医疗仪器有限公司产品；FACSCaUbur流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2 动物分组和染毒

小鼠随机分为对照组和低、中、高剂量BPA组，每组 10只。低、中、高剂量BPA组小鼠分别给予100 、200和400 mg·kg-1BPA灌胃染毒(BPA以玉米油为溶剂溶解)；对照组小鼠按体质量比例玉米油灌胃；每日晨8：00灌胃染毒，持续4周。最后一次灌胃 24 h 后，颈椎脱臼处死小鼠,取睾丸组织样品。

1.3 流式细胞术检测睾丸组织内的细胞凋亡

分别取各组小鼠左侧睾丸，剥除粘连脂肪等组织。制备单细胞悬液，将细胞浓度调整至5×105 mL-1。各组取100 μL细胞悬液，严格按照AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡试剂盒说明书完成操作，经FACSCaUbur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 免疫组织化学法检测

Fas和FADD 表达 取小鼠右侧睾丸，制作5μm睾丸组织石蜡切片，严格按照Fas和FADD免疫组织化学试剂盒说明书操作。阳性表达为细胞内呈现棕黄色颗粒。400倍或1000倍光学显微镜下随机选取10个生精小管，分别观察并计算Fas和FADD阳性细胞表达率，Fas(FADD)阳性细胞表达率=表达Fas(FADD)的阳性细胞/生精小管内所有细胞×100％。

1.5 统计学分析

采用 SPSS20.0 统计软件进行统计学分析。各组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率、FAS和FADD阳性细胞表达率以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-Neuman-Keuls法。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 流式细胞术检测各组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率

对照组和低、中、高剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率分别 为(7.52±1.78)%、(8.79± 1.14)%、(22.87±2.60)%和(58.67±1.57)%。与对照组比较，低剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)；中和高剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率升高(P<0.05)。与低剂量BPA组比较，中和高剂量BPA组细胞凋亡率均升高 (P<0.05)。见图 1和表 1。

A: Control group; B: Lowdose of BPA group; C; Moderatedose of BPA group; D: Highdose of BPA group. 图1 流式细胞术检测各组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率 Fig.1 Apoptotic rates of cells in testis tissue of mice in various groups detected by flow cytometry
图选项
表1 各组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率和Fas、FADD阳性细胞表达率 Tab.1 Apoptotic rates and positive expression rates of Fas,FADD in testis tissue of mice in various groups
(x±s,η/％)
GroupnApoptotic rateExpression rate of FasExpressionrate of FADD
*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with low dose of BPA group; # P<0.05 compared with moderate dose of BPA group.
Control107.52±1.787.91±1.266.01±1.53
Low dose of BPA108.79±1.148.86±1.315.50±0.72
Moderate dose of BPA922.87±2.60*△15.21±0.91*△12.87±0.91*△
High dose of BPA958.67±1.57*△#20.05±1.05*△#16.44±1.23*△#
表选项
2.2 免疫组织化学检测各组小鼠睾丸组织中细胞Fas表达

在对照组可见Fas少量表达；与对照组比较，低剂量BPA组Fas阳性细胞表达率无明显变化(P>0.05)；中剂量组Fas阳性细胞着色的细胞层数比例较对照组增多，Fas阳性细胞表达率升高(P<0.05)；高剂量BPA组Fas阳性细胞表达率明显升高(P<0.05)。 与低剂量BPA组比较，中和高剂量BPA组Fas阳性细胞表达率升高(P<0.05)。见图 2(插页一)和表 1。

A: Control group; B: Lowdose of BPA group; C; Moderate dose of BPA group; D: High dose of BPA group. 图2 免疫组织化学法检测各组小鼠睾丸组织中Fas表达（×100） Fig.2 Fas expression in testis tissue of mice in various groups detected by immunohistochenistry (×100)
图选项
2.3 免疫组织化学检测各组小鼠睾丸组织中细胞FADD表达

在对照组可见FADD少量表达。与对照组比较，低剂量BPA组FADD阳性细胞表达率无明显变化(P>0.05)；中和高剂量BPA组FADD阳性细胞表达率明显升高(P<0.05)；与低剂量BPA组比较，中和高剂量BPA组FADD阳性细胞表达率明显升高(P<0.05)。见图 3(插页一)和表 1。

A: Control group; B: Lowdose of BPA group; C; Moderate dose of BPA group; D: High dose of BPA group. 图3 免疫组织化学法检测各组小鼠睾丸组织中FADD表达（×100） Fig.3 FADD expression in testis tissue of mice in various groups detected by immunohistochenistry (×100)
图选项
2.4 各组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率与Fas、FADD阳性细胞表达率的相关性

中和高剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率与Fas、FADD阳性细胞表达率呈正相关关系(r=0.430，r=0.238，P<0.05；r=0.637，r=0.359，P<0.05)。见表 2。

表2 中和高剂量BPA组小鼠睾丸组织中细胞凋亡率与Fas和FADD阳性细胞表达率的相关性分析 Tab.2 Analysis on correlation between apoptotic rates and Fas,FADD positive expression rates in testis tissue of mice in moderate and high doses of BPA groups
Group Expression rate of Fas Expression rate of FADD
r P r P
Moderate dose of BPA0.4300.0020.2380.000
High dose of BPA0.6370.0000.3590.000
表选项
3 讨 论

近几年，人们对BPA的安全性及其对健康的影响研究越来越广泛，主要从免疫系统、神经系统、生殖系统及代谢、肿瘤的发生等[10]方面展开研究，尤其对生殖系统影响的研究已成为国际性热点。有研究[4, 11, 12]报道：低剂量与高剂量BPA对机体细胞造成不同程度损伤；而不同剂量BPA对雄性生殖系统的影响机制目前尚无明确的结论，需不断地完善。

本研究采用BPA灌胃染毒成年期(最佳生育期)小鼠，模拟最常见的人类及动物与BPA的接触方式。在前期研究的基础上(不同剂量BPA会造成小鼠睾丸组织损伤)，为进一步证实BPA对生殖系统的损伤作用，本课题组采用流式细胞术检测生殖细胞凋亡发现：中和高剂量BPA可造成睾丸组织中细胞凋亡率升高。细胞凋亡在精子正常发生中起重要作用，精子细胞数量的多少主要取决于细胞增殖和凋亡的动态平衡，一旦动态平衡被打破，精子细胞的数量、质量就会受到威胁，从而降低生育功能。有研究[13, 14]报道：邻苯二甲酸二辛酯和邻苯二甲酸等环境内分泌干扰物可导致睾丸组织中细胞凋亡率升高。本研究中BPA作为EDCs的一种，对睾丸组织中细胞的损伤与文献报道[13, 14]基本一致。

体内众多的基因参与正常自发性睾丸内细胞凋亡，并精准调控细胞增殖与凋亡的动态平衡，而受外源因素诱导的细胞过度凋亡其发生机制又是什么？鲍爱梅[15]在研究小鼠精子发生障碍的初步机制时发现：睾丸中有FADD基因表达，认为FADD磷酸化使染色体DNA断裂，使生精细胞凋亡率升高，造成精子生成障碍。

本研究采用免疫组织化学法检测睾丸组织中Fas和FADD表达结果显示：中和高剂量BPA组Fas和FADD阳性细胞表达上调，与对照组比较差异有统计学意义；并且与同组别睾丸组织中细胞凋亡率呈正相关关系。Fas基因属于TNF/NGF受体超家族成员，胞内含有1个由145个氨基酸组成的死亡结构域(death domain，DD)，起传导凋亡信号的作用；跨膜区由21个氨基酸组成，决定其跨膜特性；胞外区由157个氨基酸组组成，称为死亡激发域。FADD又名Fas相关死亡结构域蛋白，在细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡等众多过程中发挥重要功能，能在细胞核和细胞质之间穿梭。FADD由羧基末端的DD和氨基末端的死亡效应域(death effect domain，DED)两部分组成；BPA引起的睾丸组织中细胞凋亡很有可能是激活了FADD的DD，使其直接与Fas的DD结合，二者相互作用后，暴露FADD的DED，通过激活caspase-8酶原，引起caspase级联反应，从而激活Fas凋亡受体信号通路，引起睾丸组织中细胞凋亡。

综上所述，BPA作为一种环境内分泌激素，能够诱导小鼠睾丸组织内细胞凋亡，此凋亡受体信号通路的激活与调控基因FADD和Fas有关。通过抑制FADD表达，可阻断Fas凋亡受体诱导的细胞凋亡信号通路，解救细胞过渡凋亡，从而提高雄性动物精液质量，改善不良生育功能。本研究进一步揭示了BPA的生殖毒性及机制，提醒育龄期男性尽可能避免接触BPA。本研究结果为解决男性不育渐成为困扰全球的重大科学问题提供更加直接的理论证据。当然，BPA也可能通过其他信号通路促发细胞凋亡，本课题组将在今后的研究工作中更深入探讨。

参考文献
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