鼻病毒(human rhinovirus,HRV)是肠道病毒属单正链RNA病毒，基因组全长约7200bp，编码4个蛋白和7个非结构蛋白，目前已知超过150个血清型，根据基因特征将其分为A、B和C型^{[4, 5, 6, 7, 8]} 。HRV感染除引起流涕等普通感冒外，还可能引起哮喘急性发作和重症肺炎等，甚至死亡^{[9, 10]}。此外，不同基因型HRV在世界范围内均有不同程度流行且存在地域差异，但成都地区尚缺乏不同型别HRV流行情况的监测资料。为了解成都地区HRV的流行规律，本研究采用RT-PCR技术对2011年1月—2013年12月成都地区1117份呼吸症候群住院患儿鼻咽抽吸物标本进行了HRV核酸检测，并随机抽取部分HRV核酸阳性标本进行了VP4/VP2衣壳蛋白编码区基因序列测定及分析，现报道如下。

2011年1月—2013年12月，从成都某妇女儿童医院共采集符合发热呼吸道监测病例定义的1117份(2011年380份，2012年332份，2013年405份)住院患儿鼻咽抽吸物标本，同时收集患儿姓名、年龄、发病日期、采样日期和临床症状等信息。

参照Geneaid公司的Viral Nucleic Acid Extraction Kit VR100试剂盒说明书提取病毒的DNA或RNA。

①逆转录反应：采用Bio-Rad公司的iScript^TM cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒进行逆转录反应，逆转录体系及反应条件按照试剂盒说明书进行。②PCR反应：采用TianGen公司的Taq DNA聚合酶及PCR反应体系，HRV-5′NCR及VP4/VP2基因扩增参照参考文献[11]。同一份呼吸道样本同时还检测了流感病毒(influenza virus,Flu)A、B和C型，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV) A/B 型，副流感病毒(parainfluenza virus，PIV) 1、2、3和4型，腺病毒(adenovirus,ADV)，人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)，人冠状病毒(human coronavirus,HCoV)，人偏肺病毒(HMPV)等。③结果观察：PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳后用Bio-Rad公司全自动凝胶成像仪观察结果。

VP4/VP2基因扩增产物经2%琼脂糖电泳观察后，阳性扩增产物由上海生物工程有限公司进行纯化和测序。

多序列比对使用DNAStar4.0软件，输出的序列经过NCBI网站的Nucleotide BLAST得到型别。VP4/VP2基因序列使用MEGA6.0软件进行核酸同源性分析，根据VP4/VP2基因序列建立系统进化树，参考序列为NCBI的GenBank数据库中具有代表性的HRV病毒株。

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。不同检出率组间比较采用χ²检验。检验水准为α=0.05。

1117份(2011年380份，2012年332份，2013年405份)住院患儿鼻咽抽吸物，其中男性患者649例，女性患者468例，男女比例为1.39∶1。1117份呼吸道样本中有275份HRV-5′NCR基因检测结果呈阳性，检出率为24.62%(275/1117)，其中132份为2种或2种以上病原体的混和感染。

649例男性住院患儿中HRV检出率为25.73%(167/649)；468例女性患儿中HRV检出率为23.08%(108/468)，男女阳性检出率比较差异无统计学意义(χ²=1.033，P=0.310)。275例HRV阳性患儿中，男性和女性分别占总阳性的比例为60.73%(167/275)和39.27%(108/275)。

HRV在呼吸症候群住院患儿中，2011、2012和2013年的检出率分别为26.58%(101/380)、26.51%(88/332)和21.73%(88/405)，3年检出率比较差异无统计学意义(χ²=3.212，P=0.201)。春夏秋冬四季检出率分别为21.40%(58/271)、19.85%(54/272)、38.03%(116/305)和17.45%(47/269),不同季节检出率比较差异有统计学意义(χ²=30.22，P＜0.001)，秋季检出率最高，见表 1。HRV检出率随月份变化趋势见图 1，检出高峰集中在11月左右。

图 1 成都地区发热呼吸道症候群住院患儿HRV检出率随月份变化趋势 Fig.1 Shifting trend of HRV positive rates in hospitalized children with respiratory syndrome in Chengdu area

图选项

275例阳性患儿中，年龄最大者13岁，年龄中位数为9个月。新生儿、1～12个月、1～3岁、3～5岁、5～10岁及大于10岁年龄段HRV检出率依次为17.05%(67/393)、 31.52%(104/330)、31.33%(52/166)、 29.58%(21/71)、 26.32%(25/95)和25.81%(16/62)，各年龄段HRV检出率不同，年龄12个月之后，随患儿年龄增长HRV检出率呈下降趋势。

HRV在不同临床诊断疾病中检出率不同，在喘息性疾病、先天性心脏病、支气管肺炎和急重症肺炎中检出率较高，检出率约40%。在检测的HRV阳性病例中，单独感染143例；混合感染132例，其中双重感染96例，多重感染36例，HRV与RSV合并感染最多，其次为HPIV。见表 2。

HRV-VP4/VP2基因扩增并测序获得的序列经DNAStar 4.0和MEGA 6.0软件分析及VP4/VP2进化树分析发现：系统进化树分为3个基因簇，分别代表HRV 的3个基因型。测序获得的30条HRV-VP4/VP2序列比对结果：A、B和C 3种基因型占比分别为50.0%、13.3%和36.7%；15条HRV-A核苷酸同源性为60%～100%，组内平均遗传距离为0.221；4条B组VP4/VP2序列间核苷酸同源性为70%～76%,组内平均遗传距离为0.223，与本地区腹泻株同源性为72%～96%，与GenBank中兰州株(EU822864.1)同源性为69%～77%，与北京株(GU568090.1)同源性为72%～83%；11条C组VP4/VP2序列间核苷酸同源性为65%～100%，组内平均遗传距离为0.228。HRV各基因型内同源性较差，在进化树上分属不同支，亲缘关系较远，分别与不同的血清型同源。见图 2。

▲, :The HRV-VP4/VP2 gene sequences of diarrhea samples and respiratory tract samples. 图 2 HRV与GenBank中参考病毒核苷酸序列NJ进化树 Fig.2 Evolutionary tree of nucleotide sequences of HRV and GenBank reference strains

图选项

本研究使用敏感性和特异性均较高的Nest-PCR对2011年1月—2013年12月成都地区发热呼吸道症候群住院患儿鼻咽抽吸物样本进行了HRV的监测分析。本研究结果表明：HRV在成都地区发热呼吸道症候群患儿鼻咽抽吸物样本中总阳性检出率为24.62%，高于国内甘肃、上海和重庆等地区研究结果^{[12, 13, 14]}，低于北京和美国田纳西州的监测结果^{[3, 15]}，不同地区检测结果的差异可能是由于病例类型、检测方法等不同引起，也可能是由地区差异造成的。不同性别检出率比较差异无统计学意义，说明HRV在下呼吸道住院患儿中不存在性别易感性。在筛检阳性标本中有半数为单HRV感染，从混合感染情况看，HRV在呼吸症候群中易与RSV和HPIV形成混合感染。此外，成都地区鼻病毒秋季检出率较高，夏季检出率最低，可能与气温升高不利于鼻病毒生存有关。除新生儿组，随年龄增长HRV检出率呈下降趋势，说明HRV对低年龄、免疫力偏低的婴儿更具威胁性。新生儿组检出率较其他年龄组低可能是因为新生儿从母体获得HRV抗体，对HRV具有一定的免疫力。

本研究中基因分析结果显示：2011年1月—2013年12月成都地区存在多个HRV基因型，A、B和C型均有检出，以A型为主，C型次之，B型最少，与国内外研究结果一致^{[14, 16, 17]}，但阳性标本不同型别构成比存在一定差异，可能是由于地区差异造成的，也可能与样本量、病例构成及采用检测方法的灵敏度不同有关。对同一基因型的HRV同源性分析和系统进化树显示：HRV各型之间的毒株基因差异较大，在系统进化树上分布于不同的枝，说明成都地区存在不同基因型的共同流行。

本研究初步获得了成都地区HRV的流行病学特征，为本地区HRV防治提供了基础资料。值得注意的是，在本研究进行过程中出现3例因重症肺炎死亡的病例，而且此3例患儿均感染了HRV，其中1例在排除了常见可以引起肺炎的其他病毒和细菌外只检出了HRV。因此，有必要继续开展HRV在发热呼吸道症候群住院患儿中感染的监测，尤其是重症肺炎患儿的监测，HRV与重症肺炎之间的关系有待进一步深入研究。