慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一个日益严重的全球性公共健康问题^[1]，其发病率和死亡率正在逐年攀升，预计到2020年，COPD将居于世界死亡原因的第3位^[2]。COPD是一种以持续气道损伤为主的炎症性疾病，主要以中性粒细胞炎症为主，与患者肺部积累的中性粒细胞的数量、是否发生感染以及是否暴露于外部有害颗粒(如香烟烟雾等)因素有关^[3]，但确切机制尚不清楚。近期研究^{[4, 5]}发现：COPD的炎症反应过程与固有免疫有密切关联。人体固有免疫应答主要通过识别病原相关分子模式(PAMPs)^[6]，介导非特异性炎症反应。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、黑素瘤缺乏因子2(AIM2)和半胱天冬酶1(CASP1)在机体固有免疫反应过程中发挥了重要的作用^{[7, 8]}，而NLRP3、AIM2基因和下游基因CASP1及下游炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18 (IL-18) 所介导的固有免疫反应，在慢性阻塞性肺疾病急性发作期(acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary diseases,AECOPD)发病过程中是否激活及其具体的作用机制仍不清楚。本研究通过测定AECOPD患者及健康对照者痰液中NLRP3、AIM2和CASP1基因表达水平及其下游炎性因子IL-1β和IL-18蛋白表达水平，探讨固有免疫在AECOPD中的作用，为阐明AECOPD的发病机制和AECOPD的有效治疗提供参考。

选取吉林省医院呼吸内科确诊的AECOPD患者20例及同期参加体检的健康对照者12例，参与者签署知情同意书。该研究经吉林大学伦理委员会批准。AECOPD组：依据GOLD (global initiative for chronic obstructive lung disease) 诊断标准，一秒用力呼气容积(FEV1)<80%，一秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)<70%。至少具有以下3项中的2项(气促加重、痰量增加、痰变脓性)或者以上任一症状并伴有5d内呼吸道感染症状、无故性发热、呼吸困难和咳嗽，以上伴发症状持续2d。健康对照组：依据GOLD诊断标准，40岁以上人群，无吸烟史，肺功能正常，4周内无感冒等其他呼吸系统疾病症状。排除标准：COPD稳定期患者不列入纳入范围。调查并记录研究对象的基本个人资料及病情基本情况(性别、年龄、FEV1和FEV1/FVC)，包括临床基本情况以及调查对象急性发作期间的症状、体征和痰液细胞存活率。见表 1。

Trizol购自美国Invitrogen公司，PrimeScript^TM RT Reagent Kit，SYBR^® Premix Ex Taq^TM试剂盒购自日本Takara公司，人IL-1β 和IL-18 ELISA检测试剂盒购自美国Blue Gene公司。EPOCH微孔板分光光度计(美国伯腾仪器有限公司)，ELx800酶标仪(美国BioTek公司)，ABI 7300型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)。

①痰诱导：测定AECOPD人群和健康人群FVC、FEV1，确定基线值；吸入沙丁胺醇10 min后测FEV1，计算15%下降值。如果FEV1下降超过15%，重新吸入沙丁胺醇2喷，如果FEV1下降未到15%，分别以4.5%和0.9%生理盐水雾化诱导15.5 min，最后得到适量的诱导痰。②痰处理：在培养皿中分离黏液(1.5 mm×3.0 mm×1.0 mm)，取0.1～1.0 mL放入15 mL试管中，痰中加4倍的Sputolysin，在室温条件下振荡30~60min，而后加入4倍的PBS，继续振荡5 min，用400目细胞滤网过滤，记录收集量。吸出20μL滤过液加入EP管中，再加入20μL台盼蓝，混匀后吸取10 μL冲入细胞计数板中，显微镜(20/40倍镜)下细胞计数，计算细胞存活率。取剩余细胞滤液 3000 r·min^-1离心5 min，分离上清液用于炎性因子IL-1β及IL-18的测定，下层的细胞加入裂解液，用于NLRP3、AIM2和CASP1基因表达水平的测定。

采用Trizol法提取痰液细胞中的总RNA，使用PrimeScript^TM RT Reagent Kit试剂盒逆转录为cDNA，使用SYBR^® Premix Ex Taq^TM试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，检测 NLRP3、AIM2和CASP1基因表达水平。记录反应后的CT值，采用ΔΔCT法计算基因的表达水平。引物序列设计见表 2。

使用ELISA试剂盒，按照说明书操作检测痰上清中炎症因子IL-1β和IL-18蛋白表达水平。

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。各组研究对象痰上清液中NLRP3、AIM2、CASP1基因表达水平和IL-1β、IL-18蛋白表达水平以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

与健康对照组比较，AECOPD组患者痰上清中NLRP3、AIM2和CASP1基因表达分别上调3.83、1.70和2.42倍，AECOPD组NLRP3、AIM2和CASP1基因表达水平明显增高(P<0.01)。见表 3。

与健康对照组比较，AECOPD组患者痰上清中IL-1β和IL-18蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。见表 4。

本研究结果显示：与健康对照组比较，NLRP3、AIM2和CASP1基因表达增强，炎症细胞因子(IL-1β和IL-18)分泌增加。固有免疫介质CASP1与固有免疫细胞因子IL-18参与了气道炎症反应^{[9, 10]}，与本研究结果一致。因此本文作者认为AECOPD发病机制可能与固有免疫的活化有关。

人体固有免疫应答主要通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)^[11]，导致细胞炎症因子如IL-1β和IL-18分泌增加，介导固有免疫炎症反应。NLRP3、AIM2和CASP1基因是固有免疫中较为重要的表达基因，其中NLRP3基因是编码炎症反应中的胞浆蛋白的基因，NLRP3能与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)通过高度螺旋的热蛋白结构域(pyrindomain,PYD)相结合^[12]，并将由不同NLRP3、ASC，CARD-caspase和Cardinal组成的炎性体作为载体来调控信号转导通路。而CASP-1基因编码的半胱氨酸蛋白酶家族的CASP-1蛋白，是NLRP3炎性通路的下游炎症反应蛋白^[13]，能对IL-1β和IL-18进行剪切，促使IL-1β和IL-18成熟和释放，从而介导炎症反应。研究^[14]表明：NLRP3炎性体-CASP-1-IL-1β/IL-18调控轴的紊乱，参与了多种相关的炎症反应和组织损伤过程。CASP-1介导的炎症反应通路，也可以由一种细胞质双链 DNA感应蛋白的编码基因AIM2激活^{[15, 16]}。AIM2可以被细胞质中的双链 DNA寡聚化，而后与ASC结合，诱导了二聚体的形成，通过与CASP-1的胱天蛋白酶招募结构域作用激活CASP-1，从而促使IL-1β和IL-18的释放，调控机体的炎症反应^[15]。

在本研究中，AECOPD发生的可能机制是通过NLRP3、AIM2基因表达上调，激活CASP1，对下游炎症因子IL-1β和IL-18进行加工，进而释放成熟的炎症因子。炎症因子可以进一步募集中性粒细胞，从而放大炎症。而中性粒细胞释放的弹性蛋白酶，能降解肺内组织的弹性蛋白，破坏细胞外基质，导致肺组织支撑结构的破坏，进一步参与气道重建，诱导AECOPD发生。因此本文作者认为：固有免疫在AECOPD中发挥重要的作用。本研究结果为揭示AECOPD发病机制提供了参考。在后续的研究中，将对NLRP3、AIM2和CASP1调控通路进行深入研究，为AECOPD临床治疗打下基础。