糖尿病(diabetes mellitus,DM)是全球比较常见的慢性非传染性疾病之一，分为 1 型糖尿病(T1DM)和 2型糖尿病(T2DM)，其中T2DM 占95%以上，我国现有超过9 200万糖尿病患者，为全球第一^{[1, 2]}。调查^{[3, 4]}显示：北京和上海是我国糖尿病的相对高发区(>6%)，吉林省糖尿病患病率(3%~4%)处于中游水平。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一类能够在磷脂甘油部分的Sn-2位点选择性断裂酯键的酶,在体内分布广泛且具有多种生物学功能。胞浆型 PLA2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)包括 PLA2-ⅣA、ⅣB、ⅣC 和ⅣD 等同功酶，对 Ca²⁺具有高度敏感性^{[5, 6]}。 非 Ca²⁺依赖型 PLA2(Ca²⁺-independent phospholipase A2，iPLA2)包括PLA2-Ⅵ、ⅦB 和Ⅷ等同功酶，无需 Ca²⁺维持其催化活性。目前国内外采用PLA2基因的单核苷酸多态性(SNPs)研究PLA2基因与冠心病关联性的报道较多。有研究者^{[7, 8]}报道：PLA2基因的SNPs与炎症、动脉粥样硬化和冠心病均有关联。多数研究者认为PLA2基因的SNPs与T2DM并发其他疾病(如高血压、动脉粥样硬化和视网膜病变等)有关联。但iPLA2基因SNPs与T2DM发病的关联性尚未见报道。本研究选择hiPLA2基因家族的位于胞浆内的PLA2G6基因，采用病例对照的研究方法，探讨PLA2G6基因多态性与T2DM的关系，为T2DM的病因学研究提供依据。

研究对象来自于2002年5月—2005年5月吉林大学第一、二、三医院收治的T2DM患者和健康体检者，均为中国北方汉族人，年龄＞40岁。病例组168例，为经过临床检查(病史和生化检查)确诊的T2DM住院患者，其中男性99例，女性69例，年龄41~82岁，平均年龄(52.6±8.3)岁。对照组199名，为无T2DM的健康体检者，其中男性115名，女性84名，年龄40~72岁，平均年龄(56.7±8.9)岁。

T2DM组患者纳入标准：① 符合2007年美国糖尿病协会(ADA)关于T2DM 的诊断标准；②年龄大于40岁；③中国北方汉族人。对照组研究对象纳入标准：①年龄大于40岁；②无T2DM以及相关疾患；③中国北方汉族人。2组研究对象排除标准：①年龄小于40岁；②患有其他类型的糖尿病患者；③妊娠及哺乳期患者；④与已经纳入的研究对象有血缘关系者。

Primers 引物 (上海Sangon公司)，Taq DNA polymerase Taq 酶 (北京天为时代公司)，dNTP 核苷酸混合物、 DNA marker DL2000 DNA 标准标志物、溴酚蓝(BPB)和溴化乙锭(EB) (大连宝生物工程有限公司)，DNA extraction kit DNA 提取试剂盒、 MspⅠ、TaqⅠ 限制性内切酶和三羟甲基氨基甲烷 (美国Promega公司)，BglⅡ 限制性内切酶(英国NEB公司)。GL 16G 型高速台式离心机 (上海医用分析仪器厂)，HQ-60 型旋混合器 (北京北方同正生物技术发展公司)，Jel Doc2001 型凝胶成像系统 (美国BIO-RAD公司)，TGRADIENT 型 PCR 扩增仪(德国BIOMETRA公司)。

利用NCBI-SNP和HapMap数据库检索并下载检索 22 号染色体PLA2G6基因的SNPs，从中选出PLA2G6基因的 3 个 SNPs 位点进行分析。从网站 http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php 查找酶切位点。应用 Primer 3 软件(http://cbr-rbc.nrc-cnrc.gc.ca/cgi-bin/primer3_www. cgi)进行引物设计，利用 http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/blastview 对所设计的引物进行同源性比对。PLA2G6基因引物序列见表1。

采集病例组和对照组研究对象的外周血5 mL,提取基因组DNA，－20℃保存。

PCR反应体系:ddH₂O 18.6 μL,10×Buffer+Mg²⁺ 2.5 μL,4×dNTP (10 mol·L^-1)0.7 μL,Primer F (30 nmol·L ^-1)0.25 μL,Primer R (30 nmol·L ^-1)0.25 μL,Taq E (5 U·μL^-1)0.7 μL,DNA (20~30 μg·L^-1)2 μL。PCR反应条件:94℃、5 min;95℃、35 s,退火温度(rs2235346、rs2272831和rs2284060位点分别为63℃、61℃和62℃)、1 min,72℃、1 min,5个循环;94℃、40 s,退火温度(rs2235346、rs2272831和rs2284060位点分别为62℃、60℃和61℃)、1 min,72℃、1 min,5个循环;94℃、40 s,退火温度(rs2235346、rs2272831和rs2284060位点分别为61℃、59℃和60℃)、1 min,72℃、1 min,30个循环;72℃、10 min。

酶切反应体系:ddH₂O 7.1 μL,10×Buffer 2.0 μL,BSA (10 g·L^-1)0.2 μL,Restriction Emzyme (10 U·L^-1)0.7 μL,Production of PCR (< 1 μg)10 μL。各位点的SNPs分型见表2。

采用 SPSS 18.0 统计软件对数据进行统计学分析。采用拟合优度χ²检验分析病例组和对照组研究对象基因型频数分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。病例组与对照组研究对象等位基因与基因型的频数分布差异比较采用χ²检验。以α=0.05为检验水准。

rs2235346 位点PCR 扩增目的基因片段长度为 301 bp，经 MspⅠ酶切后，产生的酶切片段长度分别为 126 和 175 bp 。2组研究对象PLA2G6 基因 rs2235346 位点的基因型频数分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律(P＞0.05)；2组研究对象PLA2G6基因的rs2235346 位点的 G、T 等位基因频数分布比较差异无统计学意义(χ²=0.604，P=0.437)；GG、GT和TT 3种基因型频数分布比较差异亦无统计学意义(χ²=0.728，P=0.695)。见图1和表3。

Lane 1:G/G;Lane 2,3,7:G/T;Lane 4-6,8:T/T;M:DL 2 000 marker. 图 1 PLA2G6 基因rs2235346 位点MspⅠ酶切产物电泳图 Fig.1 Electrophoregram of products of rs2235346 site in PLA2G6 gene digested by MspⅠ

图选项

rs2272831 位点PCR 扩增目的基因片段长度为 258 bp，经 MspⅠ酶切后，产生的酶切片段长度分别为 124 和 134 bp，形成3种基因型。2组研究对象PLA2G6 基因 rs2272831 位点的基因型频数分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律(P＞0.05)。2组研究对象PLA2G6基因rs2272831 位点的 A、G等位基因频数分布比较差异无统计学意义(χ²=0.169，P=0.681)；GG、AG和AA 3种基因型频数分布比较差异亦无统计学意义(χ²=2.212，P=0.331)。见图2和表4。

Lane 1,2,5,6,8:G/G;Lane 3,4:A/G;Lane 7:A/A;M:DL2000 marker. 图 2 PLA2G6 基因rs2272831 位点MspⅠ酶切产物电泳图 Fig.2 Electrophoregram of products of rs2272831 site in PLA2G6 gene digested by MspⅠ

图选项

rs2284060位点PCR 扩增目的基因片段长度为 240 bp，经 TaqⅠ酶切后，产生的酶切片段长度分别为87和153 bp。2组研究对象PLA2G6 基因 rs2284060位点的基因型频数分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律(P＞0.05)。2组研究对象PLA2G6基因rs2284060位点的 T、C等位基因频数分布比较差异无统计学意义(χ²=0.038，P=0.844)；TT、TC和CC 3种基因型频数分布比较差异亦无统计学意义(χ²=0.245，P=0.885)。见图3和表5。

Lane 1,3,6,8:T/T;Lane 2,4,5:C/T;Lane 7:C/C;M:DL 2000 marker. 图 3 PLA2G6 基因rs2284060 位点TaqⅠ酶切产物电泳图 Fig.3 Electrophoregram of products of rs2284060 site in PLA2G6 gene digested by TaqⅠ

图选项

本研究中PLA2G6 基因的rs2235346、rs2272831和rs2284060 位点SNPs与T2DM的关联性分析显示：3个位点的SNPs与中国北方汉族人群中 T2DM 的发病均无明显的关联性。

T2DM 的病因复杂，目前已明确其发病是由遗传和环境因素共同作用的结果，但其具体发病机制尚不清楚。研究^{[9, 10, 11, 12]}显示：T2DM 的发病特点是渐进性的胰岛素抵抗和相对的胰岛素分泌不足，目前普遍认为胰岛素抵抗和 β 细胞分泌功能不全是T2DM发病和病程中的2个重要环节。迄今为止，关于基因多态性与T2DM关系的研究已经涉及数百个基因，其中研究较多的有胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖转运体基因、胰岛素受体底物基因和肿瘤坏死因子基因等。

PLA2是 PLA2的一个重要类型，在许多细胞中已鉴定并克隆出了 iPLA2，其功能是参与磷脂重构、花生四烯酸代谢及信号传导、细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程。iPLA2的活性受 ATP、蛋白激酶 C(PKC)、钙调蛋白和活性氧等物质的调节，不需 Ca²⁺维持其催化活性。iPLA2水解磷脂产生的分解产物——花生四烯酸及其代谢产物在葡萄糖代谢和胰岛素分泌中均起一定作用。有研究^{[13, 14]}表明:iPLA2可能参与 β 细胞的信号传导，其表达水平可影响 β 细胞的增殖和凋亡，是 β 细胞生物活动的重要参与因子，且 iPLA2亦参与葡萄糖介导的胰岛素分泌,提示 iPLA2可能通过影响 β 细胞功能进而导致 T2DM 的发生。iPLA2是体内的一大类生物活性物质，可通过自身的代谢途径产生一系列的体内炎性介质，经由炎症反应介导 T2DM 的发生。iPLA2的生理功能及其代谢产物的功能均提示其与 T2DM发病有一定的联系，但 iPLA2基因与疾病的关联性研究并不多见。

Ramanadham等^[15]研究发现: iPLA2参与了胰导β细胞的信号传导,其表达水平能够影响胰导β细胞的增殖和凋亡。PLA2G6定位于人类第22号染色体长臂(22q13)，属于iPLA2基因家族,其在磷脂的变构、花生四烯酸的释放、白三烯和前列腺素的合成、原癌基因介导的细胞凋亡及葡萄糖刺激的β细胞的离子跨膜转运中均发挥一定的作用。

有研究^{[16, 17]}表明:T2DM与胰岛β细胞凋亡增加使胰岛素分泌减少有关联，其受到遗传、肥胖、年龄和饮食等因素的影响。因而T2DM的发病可能与iPLA2有一定的联系，本研究采用PCR和RFLP法检测PLA2G6的SNPs与T2DM易感性的关系，从而进行易感基因的筛检。本研究对169例T2DM患者和199名健康对照者的PLA2G6基因的SNPs检测结果显示：2组研究对象等位基因频数比较差异均无统计学意义，3种基因型频数比较差异亦无统计学意义，表明PLA2G6突变型等位基因与T2DM的发病可能无关联。本研究未发现 iPLA2基因SNPs与中国北方汉族人群 T2DM 有关联。出现这一阴性结果的原因可能是本次研究的样本数量较小，且 T2DM 存在遗传异质性或基因外显不全，易感基因研究在不同种族和不同地区均有一定差异。虽然本研究结果为阴性，但是也不能排除 iPLA2基因及其他类型PLA2基因内的其他 SNPs 与 T2DM 有关联的可能性。本文作者在后续的研究工作中将加大样本量，并在不同的地区、不同种族人群中同时进行多个 SNPs 位点筛查。