基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)作为一种蛋白水解酶，可以水解细胞外基质(ECM)中的绝大部分成分。现在已陆续发现了28种MMPs，构成了MMPs超家族^[1]。MMPs在正常生理过程中，参与细胞外基质的更新和重塑。而在一些病理情况下如恶性肿瘤的侵袭过程中，MMPs可以降解基底膜中的Ⅳ型胶原纤维，促进肿瘤细胞的局部侵袭，并使得肿瘤细胞通过内渗、外渗作用穿透血管，造成远处转移^[2]。而组织基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)作为MMPs的天然抑制物，可以与MMPs以1∶1的比例形成复合物并进而抑制MMPs的活性^[3]。目前共分离出4种TIMPs，命名为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。TIMP-1和TIMP-2与恶性肿瘤关系的研究较多，TIMP-3和TIMP-4与恶性肿瘤的关系正逐渐为人们所认识，尤其是TIMP-3作为唯一可以结合在细胞外基质上的TIMPs而受到关注^[4]。目前关于TIMPs的研究多采用免疫组织化学染色方法，缺乏从基因调控水平上的研究，因此本文作者构建pcDNA3.1-TIMP-3真核表达载体，为进一步研究TIMP-3抑制乳腺癌早期侵袭和转移提供新的思路和方法。

乳腺癌细胞系MDA-MB-453购自中国科学院上海细胞生化研究所，大肠杆菌JM109由吉林大学免疫教研室惠赠。真核表达载体pcDNA3.1(+)购自美国Invitrogen公司，TA连接载体pMD18-T vector购自日本Takara公司,Trizol RNA 提取试剂盒、脂质体Lipofectamine^TM2000 reagent购自美国Invitrogen公司，逆转录酶、限制性内切酶、T4连接酶和Tag DNA聚合酶购自美国Clon Tech公司，DNA回收试剂盒购自美国QIAGene公司，G418购自美国Gibco公司。引物合成及测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

根据GenBank中已知TIMP-3基因序列合成引物，上游引物为5′-AAGAATTCATGACGCCTTGGCTCGGG-3′，下游引物为5′-GGTCTAGATCAGGGGTCTGTGGCATT-3′；上游引物5′端带有EcoRⅠ酶切位点GAATTC，下游引物5′端带有XbaⅠ酶切位点TCTAGA。采用异硫氰酸胍法提自人胎盘组织中提取总RNA，经RT-PCR获得TIMP-3 cDNA片段。

将TIMP-3 cDNA片段电泳后全部回收，与TA克隆载体pMD18-T vector连接后，转化感受态菌JM109，以碱裂解法提取质粒，进行酶切鉴定，释放出目的DNA片段的质粒为阳性重组质粒。用EcoRⅠ、XbaI双酶切pMD18-T-TIMP3重组质粒及pcDNA3.1载体，经T4连接酶连接，转化JM109菌，筛选阳性质粒，进行酶切鉴定并经上海生工自动测序仪测序，酶切后产生TIMP-3片段并经测序检测正确的载体即为构建成功的pcDNA3.1-TIMP-3真核表达载体。

MDA-MB-453细胞和NIH3T3细胞培养于含10%小牛血清的IMDM培养液中，置于37℃、5%CO₂培养箱中。

按照脂质体Lipofectamine^TM2000 reagent说明书操作。将pcDNA-TIMP3重组载体转染入MDA-MB-453细胞，同时以转染pcDAN3.1空载体的细胞作为对照。在含有G418(100 mg·L^-1)的选择性培养基中加压筛选4周，获得具有抗G418抗性的单细胞克隆，收集细胞进行Western blotting鉴定，阳性克隆进行扩增培养，用于下一步细胞功能实验。

MDA-MB-453细胞分为正常对照组、pcDNA空载体组(只转染pcDNA空载体)和pcDNA-TIMP-3组(转染pcDNA-TIMP-3)。

采用MTT法测定pcDNA组与pcDNA-TIMP-3组MDA-MB-453细胞增殖活性。各组MDA-MB-453细胞按6×10⁴mL^-1接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24h后，每孔分别加入10μL的MTT(5g·L^-1)溶液，4h后终止培养，移除上清，加入100μL DMSO振荡10min，采用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定各孔吸光度(A)值，以此表示细胞增殖活性^{[5, 6]}，A值越大，细胞增殖活性越强。pcDNA组与pcDNA-TIMP-3组各设6复孔。

采用Boyden小室侵袭实验，NIH3T3细胞培养液作为趋化因子，加入Boyden小室的下室。两室之间Matrige膜上分别包被不同细胞外基质成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)、纤维连接蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)和玻璃连接蛋白(VN)。上室加入各组MDA-MB-453细胞悬液，含1.5×10⁶个细胞，培养6h，显微镜下计数，每组设3个平行样本。以穿过Matrigel膜的侵袭细胞数作为判断各组MDA-MB-453细胞侵袭性的指标。

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。各组MDA-MB-453细胞增殖活性和侵袭细胞数以x±s表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

提取人胎盘TIMP-3总RNA，RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见1条大小约633bp的亮带，与目的基因片段大小相同，即TIMP-3 cDNA片段，以cDNA为模板再次进行PCR(巢式PCR)，获得了较高含量的目的基因。见图1。

Lane1:DL 2400 DNA marker; Lane 2:TIMP-3 gene product. 图 1 TIMP-3 基因RT-PCR扩增产物电泳图 Fig.1 Electrophoregram of RT-PCR amplification product of TIMP-3 gene

图选项

pcDNA-TIMP-3重组载体经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见1条大小约633bp的亮带，即TIMP-3基因片段，经测序后与GenBank序列完全相同，表明pcDNA3.1-TIMP-3重组真核表达载体构建成功。见图2。

Lane 1:DL 2000 DNA marker; Lane 2: pcDNA-TIMP-3. 图 2 pcDNA-TIMP-3载体经EcoRⅠ和XbaⅠ酶切鉴定电泳图 Fig.2 Electrophoregram of digestion identification of pcDNA-TIMP-3 by EcoRⅠ and XbaⅠ

图选项

转染pcDNA-TIMP-3表达载体的MDA-MB-453细胞有高丰度的TIMP-3蛋白表达。见图3。

Lane 1:Protein marker; Lane 2:pcDNA-TIMP-3. 图 3 Westernblotting法检测重组TIMP-3蛋白电泳图 Fig.3 Electrophoregram of TIMP-3 protein detected by Westernblottingmethod

图选项

pcDNA-TIMP-3组细胞平均A值为0.68±0.01，pcDNA空载体组和正常对照组细胞的平均A值分别为1.09±0.04和1.12±0.08。pc-DNA-TIMP-3组细胞的增殖活性明显低pcDNA空载体组和正常对照组(P < 0.05)。

与pcDNA空载体组和正常对照组比较，pcDNA-TIMP3组穿透以Col Ⅰ、LN、FN和VN包被的Matrigel膜的侵袭细胞数明显减少(P < 0.05)。见表1。

乳腺癌是严重危害妇女健康的常见恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势^[7]。乳腺癌的侵袭及转移造成患者较差的预后^[8]。而乳腺癌细胞在侵袭、转移过程中必须突破细胞外基质等一系列自然屏障，MMPs及其抑制剂TIMPs是参与降解细胞外基质的重要酶类^[9]。

有研究^[10]表明：MMPs与TIMPs在恶性肿瘤中失去平衡，TIMPs无法抑制MMPs的水解活性，从而造成恶性肿瘤的侵袭和转移。目前关于TIMP-3与乳腺癌转移关系尚缺乏基因水平的研究。本研究中首次构建了TIMP-3真核表达载体，通过人为上调乳腺癌细胞TIMP-3的表达水平，观察其对乳腺癌细胞生长和侵袭的影响。

本研究采用的pcDNA3.1真核表达载体，具有巨细胞病毒强启动子CMV序列，确保目的基因的高水平表达，载体中还有双重选择标记和复制序列，在原核细胞中有氨苄抗性，在真核细胞中有新霉素抗性，更方便目的基因的筛选^[11]。本研究将重组载体再经双酶切、鉴定、测序，所得到的片段与报道序列的同源性达100%，说明本研究的载体构建完全成功。

将pcDNA3.1-TIMP-3重组真核表达载体转染入MDA-MB-453细胞，并与MDA-MB-453细胞同时进行G418筛选，Western blotting法检测结果显示：原本无TIMP-3表达的MDA-MB-453细胞均稳定表达了TIMP-3。

转染TIMP-3基因后MDA-MB-453细胞的增殖活性较转染了pcDNA空载体及未转染TIMP-3基因的MDA-MB-453细胞明显减弱，表明TIMP-3表达上调后对乳腺癌细胞的生长和增殖有抑制作用。其可能机制是：①TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4的过量表达均可抑制肿瘤细胞生长^[12]；②TIMP-3可抑制人类成纤维细胞生长因子诱导的内皮细胞生长^[13]；③另外有研究^[14]表明:TIMP-3的过表达可诱发数种肿瘤细胞及小鼠血管平滑肌细胞的凋亡。本研究Boyden小室侵袭实验表明：TIMP-3还可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-453穿透人工基底膜的能力。由于人工基底膜的主要成分是ColⅠ、FN、LN和VN，而MMP-2、MMP-9是降解这些胶原的主要酶类^[15]，因此本研究结果提示：MMP-2、9的活性受到TIMP-3的抑制，转染了TIMP-3基因的细胞侵袭能力有所下降。基底膜对维持BM结构的完整起重要作用，是肿瘤浸润与转移的重要屏障。转染TIMP-3基因后可望在一定程度上限制肿瘤细胞的侵袭和转移。此外还有研究^{[16, 17]}表明：TIMP-3具有抑制肿瘤新生血管的作用。

综上所述，本研究成功获得了稳定表达TIMP-3蛋白的乳腺癌MDA-MB-453细胞系。本研究结果为进一步研究TIMP-3在乳腺癌侵袭中的作用及其机制奠定了实验基础。