生物信息学是将分子生物学与信息处理技术结合，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的交叉学科，其目的是利用各种数据库，分析整理其数据的意义而揭示大量复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库是由美国国家癌症研究所(NCI)及国家人类基因组研究所(NHGRI)联合建立，其中包含丰富的数据类型和肿瘤类型，不需任何费用即可获得大量数据，其次在TCGA下载的数据已经经过了前期繁琐的标准化处理，节省了人工处理时间和资源。 Grieb等^[1]使用TCGA数据库成功筛选出治疗三阴性乳腺癌的新靶分子双微体2癌基因结合蛋白(MDM2 binding protein,MTBP)。Yang等^[2] 通过分析TCGA数据库为卵巢癌的治疗提供新的思路。本研究利用TCGA数据库下载和分析宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CESC)组织相对于配对正常组织中miRNA和基因的表达是否有显著差异，寻找潜在的可用于诊断CESC的肿瘤标志物。miRNAs是一类长度为18~25个核苷酸的单链非编码RNA，在细胞的生存、增殖和肿瘤形成过程中发挥重要的作用^{[3, 4]}。在动物细胞中成熟的miRNA主要通过与目的基因调控序列的3′端 非翻译区(3′-UTR)结合而使mRNA降解或抑制其转录后翻译过程使蛋白水平下降，从而起到调节基因表达的作用^[5]。研究^[6]显示：miRNA还可以受到其上游基因、转录因子及表观遗传因子的调控参与肿瘤的发生发展过程。在宫颈癌的研究^{[7, 8, 9]}中已证实：miR-182通过调控DNMT3a促进癌细胞凋亡,miR-21的表达水平可作为肿瘤的预后标志物,miR-133a作为治疗肿瘤的潜在靶基因。本研究通过生物信息学方法预测差异性miRNA及其靶基因，正确认识miRNA与靶基因的相互作用，为进一步研究CESC诊断标志物及其发生机制奠定基础。

使用TCGA数据库获取CESC肿瘤和正常配对组织的基因数据及miRNA数据。

进入TCGA数据门户主页，选择对应的肿瘤进入下载页面。在下载页面中选miRNAseq和RNAseqV2，选中肿瘤组织和正常组织的配对样本，点击“Build Archive”输入邮箱地址，根据所提供的链接开始下载数据。

在TCGA下载的数据中，每个样本的基因和miRNA均为有独立编号的文件，肿瘤组织样本和正常组织样本一一对应，将每种肿瘤标准化的基因或miRNA数据汇总到Excel表格里，建立原始的数据库。

①为提高筛选的准确性和简化筛选过程，首先剔除肿瘤或正常组织中荧光信号值为0的基因或miRNA数据，这些数据是芯片在检测过程中由本底的荧光值决定的；②对肿瘤组织数据和正常组织数据进行统计学分析，P < 0.05为差异有统计学意义，纳入筛选范畴；③肿瘤组织荧光均值/正常组织荧光均值≥2被认为是上调的基因或miRNA，肿瘤组织荧光均值/正常组织荧光均值≤0.05为下调的基因或miRNA，纳入后续的分析。

为评价本研究方法特异性和敏感性的关系，用Medcalc软件绘制ROC曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合。曲线下面积(AUC)越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在 0.5～0.7时诊断价值较弱，AUC在0.8～0.9时有一定诊断价值，AUC在0.9以上时有较高诊断价值。AUC=0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。

YI是灵敏度与特异度之和减去1，表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力,YI越大说明筛查的效果越好，真实性越大。

使用TargetScan、PICTAR、miRWalk、miRanda和DIANAmT 5个常用的miRNA靶基因预测网站对差异表达的miRNA分别进行靶基因预测，5个网站全部预测出的靶基因为有效靶基因。根据miRNA与靶基因呈负调控关系，将上调miRNA的预测靶基因与差异性表达下调基因汇总，将下调miRNA的预测靶基因与差异性表达上调基因汇总，重合基因即为差异miRNA在CESC中的靶基因。

利用KEGG数据库筛选出差异表达的基因参与的肿瘤相关信号通路，确定影响CESC发生发展的基因。

采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。对CESC组织与配对正常组织基因和miRNA的差异进行正态性检验，符合正态性分布的样本组间比较采用配对样本t检验，否则采用配对秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

与同源正常组织比较，在CESC组织中共有18个miRNAs(P < 0.05)和1 180个基因(P < 0.05)差异性表达，其中miRNA有15个上调，3个下调；基因有411个上调，770个下调。见表1。

ROC曲线结果显示：筛选出的18种差异性表达miRNA的灵敏度、特异度均为100%，AUC均为1，约登指数均为1，提示筛选出来的miRNA作为肿瘤标志物的效力强。

通过TargetScan、PICTAR、miRWalk、miRanda和DIANAmT 5个靶基因网站的预测，预测出靶基因的miRNA共9个，其中7个上调，2个下调；根据靶基因预测网站共筛选出靶基因97个，其中91个下调，6个上调。

采用KEGG信号通路数据库对miRNA调控基因参与信号通路研究显示：由miRNA调控的基因可能广泛参与肿瘤相关信号通路，包括MAPK、Wnt、P53、cAMP及AMPK信号通路。在肿瘤相关通路中有7个由miRNA调控的基因参与，6个基因下调，1个基因上调(表2)。

宫颈癌是妇女生殖系统中最常见的恶性肿瘤，CESC占宫颈癌的80%～85%^[10]，高发年龄为50～55岁。近年国外研究^[11]报道：在普通人群中宫颈癌的发病率有所下降,但在发展中国家,尤其在我国,由于人乳头瘤病毒(HPV)感染增多、性传播疾病和筛查程序的混乱等原因,宫颈癌的发病率和死亡率反而增加并呈年轻化倾向,其中99.7%的宫颈癌与HPV感染相关。虽然子宫颈细胞学的早期检查联合手术和放化疗的综合治疗方案已明显改善宫颈癌患者的生活质量，但肿瘤的侵袭和转移却难以根治，这也是绝大多数宫颈癌患者死亡的主要因素。因此，病因预防、早期发现和控制肿瘤的转移对提高宫颈癌患者的生存率，降低死亡率有重要意义。

目前miRNA已是基因表达调控网络中重要的组成部分,可能参与调控多条信号传导通路。不同肿瘤组织中含有不同的miRNA表达谱,对不同肿瘤组织特定miRNA表达水平的研究不仅有利于阐明肿瘤的发生发展机制,更为肿瘤的早期诊断和治疗提供了理论依据。近年来研究报道宫颈癌与miRNA的异常表达有密切关系。Shi等^[12]研究发现：miR-218多态性(rs11134527)与中国人子宫颈癌的发病有关。Wilting等^[13]运用直接定量甲基化特异性PCR发现宫颈癌组miRNA甲基化程度与对照组miRNA甲基化程度存在明显差异，证实宫颈癌的发生发展与miRNA的甲基化有关。HPV感染者中miRNA-218下调参与宫颈癌的发病机制也已经被证实^{[14, 15]}。本研究通过比较CESC与宫颈正常组织筛选出差异表达的miRNA，并通过靶基因预测网站找出CESC中差异表达的miRNA可能的靶基因，并且将靶基因进行肿瘤相关信号通路分析，找出参与肿瘤发生发展的基因，进而推测miRNA在CESC中的作用。

本研究通过比较CESC组织与配对正常组织，共发现有18个miRNA和1180个基因差异表达，通过对差异表达的miRNA行ROC曲线分析发现其特异度和灵敏度较高，提示筛选出来的差异表达的miRNA可作为潜在的肿瘤标志物。运用生物信息学靶基因预测网站发现：hsa-miR-27a、hsa-miR-148b、hsa-miR-185、hsa-miR-200a、hsa-miR-200b、hsa-miR-221和hsa-mir-133b可以预测到靶基因；通过KEGG数据库对信号通路分析显示：靶基因参与肿瘤相关信号通路包括Wnt信号通路、MAPK信号通路、P53信号通路和cAMP信号通路，提示差异表达的miRNA及其靶基因可能在CESC的发生发展中起重要作用。由于本研究的样本数量有限，hsa-miR-27a、hsa-miR-148b、hsa-miR-185、hsa-miR-200a、hsa-miR-200b、hsa-miR-221和hsa-mir-133b做为CESC诊断标志物的准确性和特异性仍需进一步验证。