吉林大学学报(医学版)  2016, Vol. 42 Issue (01): 80-84

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杨擎, 隋欣, 王宝森, 于智莘, 朱凯, 律广富, 王建玮, 闫文昊, 张慧媛, 林嘉楠, 刘英娜, 李娜, 曲晓波
YANG Qing, SUI Xin, WANG Baosen, YU Zhixin, ZHU Kai, LYU Guangfu, WANG Jianwei, YAN Wenhao, ZHANG Huiyuan, LIN Jianan, LIU Yingna, LI Na, QU Xiaobo
五味子乙素对谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其机制
Protective effect of schizandra B on injury of SH-SY5Y cells induced by Glu and its mechanim
吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 80-84
Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(01): 80-84
10.13481/j.1671-587x.20160116

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收稿日期: 2015-09-30
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杨擎, 隋欣, 王宝森, 于智莘, 朱凯, 律广富, 王建玮, 闫文昊, 张慧媛, 林嘉楠, 刘英娜, 李娜, 曲晓波. 五味子乙素对谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版), 2016, 42(01): 80-84.
YANG Qing, SUI Xin, WANG Baosen, YU Zhixin, ZHU Kai, LYU Guangfu, WANG Jianwei, YAN Wenhao, ZHANG Huiyuan, LIN Jianan, LIU Yingna, LI Na, QU Xiaobo. Protective effect of schizandra B on injury of SH-SY5Y cells induced by Glu and its mechanim[J]. Journal of Jilin University (Medicine Edition), 2016, 42(01): 80-84.
五味子乙素对谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其机制
杨擎, 隋欣, 王宝森, 于智莘, 朱凯, 律广富, 王建玮, 闫文昊, 张慧媛, 林嘉楠, 刘英娜, 李娜 , 曲晓波     
长春中医药大学研发中心药理实验室, 吉林长春 130117
收稿日期: 2015-09-30
基金项目: 吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20130522046JH);吉林省教育厅"十二五"科学技术研究项目资助课题(201484); 吉林省卫生厅青年科研基金资助课题(2013Q001);吉林省卫生计生委科研计划项目资助课题(2014Z024)
作者简介: 杨擎(1989-),女,吉林省长春市人,在读中药学硕士,主要从事分子药理学方面的研究。
通信作者: 李娜,副研究员(Tel:0431-86172151,E-mail:lhaln@hotmail.com);
曲晓波,教授,博士研究生导师(Tel:0431-86172151,E-mail:quxiaobo0504@hotmail.com)
摘要: 目的: 探讨五味子乙素(Sch B)对谷氨酸(Glu)致人神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,阐明其对ATR信号通路的影响。 方法: 将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞分为对照组、DMSO组、模型组、Sch B1组、Sch B2组和Sch B3组。对照组SH-SY5Y细胞不做任何处理;DMSO组SH-SY5Y细胞用17 mmol·L-1 DMSO作用24h;模型组SH-SY5Y细胞用20 mmol·L-1 Glu孵育24h造成细胞损伤模型;Sch B1、Sch B2和Sch B3组采用0.05、 0.10和1.00 μmol·L-1浓度Sch B预处理SH-SY5Y细胞24 h后再用Glu(20 mmol·L-1 )继续孵育24 h。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blotting法检测ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白表达情况。 结果: MTT法检测,与模型组比较,Sch B1、Sch B2和Sch B3组细胞存活率明显升高(P<0.05或P<0.01),且Sch B2组细胞存活率最高,故选取Sch B2组作为Sch B组进行后续实验。细胞周期检测,与对照组比较,模型组G0/G1期细胞所占百分比降低(P<0.05),S期和G2/M 期细胞所占百分比升高(P<0.05);与模型组比较,Sch B组G0/G1期细胞所占百分比升高(P<0.05),S期和G2/M 期细胞所占百分比降低(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,模型组细胞中ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,Sch B组细胞中ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白表达水平均降低(P<0.05)。 结论: Sch B对Glu致SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能与下调ATR信号通路、减少细胞周期阻滞有关。
关键词: 五味子乙素    ATR信号通路    SH-SY5Y细胞    谷氨酸    
Protective effect of schizandra B on injury of SH-SY5Y cells induced by Glu and its mechanim
YANG Qing, SUI Xin, WANG Baosen, YU Zhixin, ZHU Kai, LYU Guangfu, WANG Jianwei, YAN Wenhao, ZHANG Huiyuan, LIN Jianan, LIU Yingna, LI Na, QU Xiaobo     
Pharmacology Laboratory, Research and Development Center, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China
Abstract: Objective: To investigate the protective effects of schizandra B (Sch B)on the injury of human neuroblastoma SH-SY5Y cells induced by glutamic acid (Glu), and to clarify its influence in ATR signaling pathway.Methods: The SH-SY5Y cells were divided into control group,dimethyl sulfoxide(DMSO)group,model group,Sch B1 group,Sch B2 group,and Sch B3 group.The SH-SY5Y cells in control group were untreated; the SH-SY5Y cells in DMSO group were treated with DMSO (17 mmol·L-1)for 24 h;the SH-SY5Y cells in model group were treated with Glu (20 mmol·L-1)for 24 h. The SH-SY5Y cells in Sch B1 group,Sch B2 group,and Sch B3 group were firstly pretreated with Sch B (0.1 μmol·L-1)for 24 h,and exposed to 20 mmol·L-1 Glu for 24 h at the same time.The survival rate of SH-SY5Y cells was detected by MTT assay,and the changes of cell cycle of SH-SY5Y cells were determined by flow cytometry.Western blotting method was used to detect the protein expressions.Results: The MTT detection results showed that compared with model group,the survival rates of SH-SY5Y cells in Sch B1 group, Sch B2 group,and Sch B3 group were increased (P<0.05 or P<0.01),and the survival rate in Sch B2 group was the highest (P<0.01),the Sch B2 group was selected as Sch B group for the following experiment.The cell cycle detection results showed that the percentage of SH-SY5Y cells in model group at G0/G1 phage was decreased(P<0.05); compared with control group,the percentages of SH-SY5Y cells in model group at S phage and G2/M phage were increased (P<0.05);compared with model group, the percentage of SH-SY5Y cells in Sch B group at G0/G1 phage was increased (P<0.05),and the percentages of SH-SY5Y cells in Sch B group at S phage and G2/M phage were decreased (P<0.05). The Western blotting detection results showed that compared with control group,the expression levels of ATR,p-CHK1,p-Cdc25c and P53 proteins in the SH-SY5Y cells in model group were increased (P<0.05);compared with model group,the expression levels of ATR,p-CHK1,p-Cdc25c and P53 proteins in the SH-SY5Y cell in Sch B group were decreased (P<0.05). Conclusion: Sch B could protect the damage of SH-SY5Y cells by GLu,and its mechanism may be related to inhibiting the ATR signaling pathway and reducing the cell cycle arrest.
Key words: schizandra B    ATR signaling pathway    SH-SY5Y cell    glutamic    

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经退行性病变，是老年痴呆常见原因，主要表现为认知障碍、记忆丧失和沟通不良等[1]。谷氨酸(glutamic,Glu)在AD等神经退行性疾病中起着重要的作用，能引起神经兴奋性毒性，导致神经细胞内分解代谢酶活性增加[2]，引起氧化损伤和DNA损伤[3, 4]。DNA损伤后可引发ATR信号途径，导致下游因子CHK1和Cdc25c磷酸化反应，诱导细胞周期阻滞。

在《神农本草经》记载中，将五味子[Schisandra Chinensis (Turcz.) Baill.]列为上品，其中主要有效活性成分为 五味子乙素(schizandraB,Sch B)[5]，Sch B能保护神经细胞氧化损伤，增强线粒体功能和结构的完整性[6]。有研究[7, 8]显示：Sch B对神经系统具有保护作用，能减轻神经细胞DNA损伤。但Sch B 对Glu致神经细胞损伤的保护作用及对ATR信号通路的调节机制尚未见报道。现代研究[9]表明：SH-SY5Y细胞的形态和生理功能均与正常神经细胞相似，被广泛用于神经退行性疾病方面研究 。本研究旨在探讨Sch B对Glu致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及对ATR信号通路调控的影响。

1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂

SH-SY5Y细胞由吉林大学基础医学院药理实验室提供。Glu购于生工试剂公司。Sch B购于上海源叶生物科技有限公司，Sch B用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成100 mol·L-1 浓缩液，-20℃保存，使用时用1640培养液稀释配制成所需浓度工作液。四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Amresco公司，RPMI-1640购于美国Corning公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，β-actin、ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53试剂盒购于美国Proteintech公司，山羊抗小鼠抗体、山羊抗兔抗体和BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 细胞培养与分组

将SH-SY5Y细胞用RPMI-1640培养基(10%胎牛血清，0.5%庆大霉素，1%两性B霉素)放入含有5%CO2、37℃培养箱中培养。2d换液1次，3~4d传代1次，待细胞处于对数生长期进行实验及相关检测。SH-SY5Y细胞分为对照组、DMSO组、模型组、Sch B1组、Sch B2组和Sch B3组。细胞接种24h后，DMSO组给予17mmol·L-1DMSO，Sch B1、Sch B2和Sch B3组分别给予0.05、0.10 和1.00 μmol·L-1Sch B预处理24h后，除对照组和DMSO组外，均给予20 mmol·L-1 Glu[10]继续孵育细胞24h，消化收集细胞测定各项指标。

1.3 MTT法测定细胞存活率

SH-SY5Y细胞以每孔4×104 mL-1接种于96孔板中，每组细胞8复孔，培养结束前4h每孔加入20μL MTT，培养结束后吸去培养液，每孔加入150μL DMSO，震荡10 min后，使结晶完全溶解，在495nm波长下测定吸光度(A)值。对照组细胞存活率设为100%， 计算其余各组细胞存活率 ,细胞存活率=(各实验组A值/对照组A值)×100% 。

1.4 流式细胞术测定细胞周期

SH -SY5Y 细胞以6×104 mL-1浓度接种于6孔板中，按照上述方法处理后胰酶消化收集，再用PBS洗2~3次，每组细胞加入1 mL预冷75%乙醇，-20℃冰箱内过夜，1 000 g离心5 min，1 mL预冷PBS洗涤，用碘化丙啶染色液后上机检测。

1.5 Western blotting法检测ATR信号通路相关蛋白表达

细胞经上述方法处理后胰酶消化收集，提取蛋白用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。进行SDS-PAGE垂直电泳，然后电转至PVDF膜上。转膜后用TBST清洗膜3次，每次5 min，脱脂奶粉封闭1h，再用TBST洗膜。将膜放入稀释好的β-actin(1∶20 000稀释)、ATR(1∶1000稀释)、p-CHK1(1∶500稀释)、p-Cdc25c(1∶500稀释)和P53(1∶500稀释)中，4℃孵育过夜，在二抗(1∶2 000稀释)中室温孵育1h，TBST洗膜，在NBT/BCIP显色液中避光显色，用凝胶成像分析系统测定灰度值，各组蛋白表达强度=实验组灰度值/对照组灰度值，进行半定量分析。

1.6 统计学分析

利用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。各组SH-SY5Y细胞存活率、细胞周期中各期细胞所占百分比和ATR信号通路相关蛋白表达水平均以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK-q法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 各组SH-SY5Y细胞存活率

与对照组比较，DMSO组细胞存活率无明显变化(P>0.05) ，模型组SH-SY5Y细胞存活率明显降低(P<0.05)；与模型组比较，Sch B1 、Sch B2和Sch B3组细胞存活率均升高(P<0.05或P<0.01)。其中Sch B2组细胞存活率最高，选取Sch B2组(0.10 μmol·L-1 Sch B+ 20 mmol·L-1 Glu)作为Sch B组进行以下实验相关指标检测。见表 1。

表 1 各组SH-SY5Y细胞存活率 Tab.1 Survival rates of SH-SY5Y cells in various groups
(n=8,x±s,η/%)
GroupDose(μmol·L-1)Survival rate
*P<0.05 compared with control group;△ P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.
Control0.00100.00±0.00
DMSO0.0097.78±8.82
Model0.0068.80±6.10*
Sch B10.0579.69±6.52△
Sch B20.1091.22±3.35△△
Sch B31.0082.01±3.35△
表选项
2.2 各组SH-SY5Y细胞不同细胞周期百分比

与对照组比较，模型组G0/G1期细胞所占百分比降低(P<0.05)；与模型组比较，Sch B组G0/G1期细胞所占百分比明显升高(P<0.05)，提示对照组和Sch B组细胞均处于静止期，对照组细胞较模型组细胞稳定。与对照组比较，模型组S期和G2/M期细胞所占百分比明显升高(P<0.05),提示出现了细胞周期阻滞；与模型组比较，Sch B组S期和G2/M期细胞所占百分比明显降低 (P<0.05)。见图 1和表 2。

A:Control group;B:Model group;C:SchB group. 图 1 各组SH-SY5Y细胞不同细胞周期流式细胞术检测结果 Fig.1 FCM results of Cell cycle of SH-SY5Y cells in various groups
图选项
表 2 各组SH-SY5Y细胞不同细胞周期百分比 Tab.2 Percentages of SH-SY5Y cells at different cell cycles in various groups
(n=3,x±s,η/%)
Group Percentage of SH-SY5Y cells
G 0/G 1 S G 2/M
*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.
Control52.24±0.2544.51±0.271.74±0.09
Model16.63±0.14*65.90±0.32*17.47±0.19*
Sch B48.24±1.42△48.35±1.17△3.40±0.05△
表选项
2.3 各组SH-SY5Y细胞ATR信号通路相关蛋白表达水平

与对照组比较，模型组ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白的表达水平均明显 增加(P<0.05)；与模型组比较，Sch B组ATR、p-CHK1、p-Cdc25c和P53蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05)。见图 2和表 3。

Lane 1:Control group;Lane 2:Model group;Lane 3:Sch B group. 图 2 各组SH-SY5Y细胞ATR信号通路相关蛋白表达电泳图 Fig.2 Electrophoregram of expressions of ATR signaling pathway related proteins in SH-SY5Y cells in various groups
图选项
表 3 各组SH-SY5Y细胞ATR信号通路相关蛋白表达水平 Tab.3 Expression levels of ATR signaling pathway related proteins in SH-SY5Y cells in various groups
(n=3,x±s)
GroupDose(μmol·L-1)ATRp-CHK1(ser317)p-Cdc25c(ser216)P53
*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.
Control0.01.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00
Model0.01.29±0.05*1.10±0.09*1.17±0.06*1.15±0.11*
Sch B0.11.05±0.03△1.03±0.07△0.97±0.02△0.96±0.09△
表选项
3 讨 论

Glu作为一种兴奋型氨基酸能引起神经兴奋性毒性，诱导神经元损伤，Glu神经毒性损伤是AD神经退行性疾病产生的重要因素。研究[11, 12]表明:Sch B对损伤后的神经细胞具有保护作用。本研究结果显示：Sch B作用于Glu致损伤SH-SY5Y细胞后细胞存活率明显升高，提示Sch B对Glu诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用。高浓度Glu产生过多自由基导致DNA损伤，DNA损伤后可在G0/G1期、S期和G2/M期3个检查点进行DNA修复，如果不能及时修复将会进一步导致细胞周期阻滞或凋亡。本研究结果显示： SH-SY5Y细胞经 Sch B预保护后G0/G1期细胞百分比升高，S期和G2/M期细胞百分比均降低，提示Sch B可能抑制Glu致损伤的SH-SY5Y细胞在S期和G2/M 期的细胞周期阻滞。

ATR是DNA损伤早期信号传导重要的感受因子，DNA损伤诱导ATR被激活，ATR蛋白激酶识别DNA损伤引起的DNA双链断裂，并进行DNA修复，同时ATR诱发下游细胞因子磷酸化。CHK1作为ATR重要的下游靶点，是ATR信号通路下游检测点，参与ATR信号通路的调节，ATR信号传导使CHK1 Ser317位点磷酸化而激活，磷酸化的CHK1(p-CHK1)诱导细胞在S和G2/M期周期延迟或阻滞，进而促使下游因子Cdc25c蛋白的磷酸化(p-Cdc25c)，使细胞在G2/M 期阻滞[13]。p-CHK1可激活P53蛋白，当损伤严重时，依赖P53的凋亡反应被启动，引起细胞凋亡[14]，同时ATR也能直接激活P53蛋白，使细胞滞留在S期和G2/M期[15]。本实验结果显示：Sch B预保护后 SH-SY5Y细胞中 ATR蛋白表达减少，下游p-CHK1(ser317)、p-Cdc25c(ser216)和P53相关因子表达减少，提示Sch B可能通过抑制ATR信号通路的传导及下游因子的激活，减轻细胞周期阻滞，从而降低Glu诱导的SH-SY5Y细胞DNA损伤。

综上所述，Sch B通过抑制ATR信号通路活性，调节S期和G2/M期细胞阻滞，对Glu致 SH-SY5Y细胞损伤起到保护作用，本研究结果为Sch B在AD退行性病中作用的研究提供了理论依据。

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