目前国内外对于卵巢癌的治疗仍以手术联合化疗为主，但大部分晚期患者由于出现转移或术后复发而死亡^{[1, 2]}。铂类联合紫杉醇是目前卵巢癌的一线化疗方案，但一些患者对铂类药物的低应答状态是影响化疗效果及卵巢癌预后的主要原因。褪黑素(melatonin,MLT)是一种在人体生理过程中很多环节起到重要作用的吲哚类激素^{[3, 4]}，并具有一定的抑制肿瘤生长的作用。研究^{[5, 6, 7, 8]}表明：MLT对消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等具有显著的抑制作用。但MLT与卡铂(carboplatin,CBP)联合在卵巢癌化疗方面应用的研究国内外尚无相关报道。本研究以卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，通过MTT比色法、流式细胞术及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测，探讨MLT联合CBP对卵巢癌SKOV3细胞体外增殖及凋亡的作用，并初步探讨其作用机制，旨在为卵巢癌临床化疗新策略提供理论依据。

人卵巢癌SKOV3细胞由吉林大学基础医学院病理研究室提供。MLT粉剂为瑞士ALEXIS公司产品，CBP冻干粉剂产自齐鲁制药，标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品公司，RPMI-1640购自美国Gibco公司，青霉素和链霉素购自华北制药股份有限公司，MTT 粉末购自美国Sigma公司，凋亡试剂盒购自南京KeyGEN 公司，PCR试剂购自北京全式金生物技术公司。引物由Primer 5.0 软件设计，引物序列由上海生工生物公司合成。

人卵巢癌SKOV3细胞加入到含有100U·mL^-1青霉素、100U·mL^-1链霉素、10%新生牛血清和600g·mL^-1 G418的RPMI-1640培养液中，于37℃、5%CO₂的孵箱中培养，每24h换液1次。将处于对数生长期的SKOV3细胞消化后进行计数，以5×10⁴mL^-1密度接种于96孔板上培养，取生长状态良好的细胞进行实验。根据孔板内加入药物不同浓度进行实验分组 ：空白对照组、 MLT组(1和2 mmol·L^-1)、CBP组(12.5、 25.0和50.0mg·L^-1)、联合用药组(1 mmol·L^-1MLT联合12.5 mg·L^-1CBP组，2 mmol·L^-1 MLT联合12.5mg·L^-1CBP组，1 mmol·L^-1MLT联合25.0mg·L^-1CBP组，2 mmol·L^-1 MLT联合25.0mg·L^-1CBP组，1 mmol·L^-1MLT 联合50.0mg·L^-1CBP组，2 mmol·L^-1MLT联合50.0mg·L^-1CBP组)。每组设3复孔。

5×10⁴mL^-1 SKOV3细胞接种于96孔板，每孔200 μL。细胞贴壁后，各实验组按分组情况每孔加入不同浓度的MLT、CBP培养液。作用48h后，每孔加入10μL MTT 溶液，5%CO₂、37℃避光培养4h后终止培养，每孔加100μL DMSO，低速振荡10min，使结晶物充分溶解。用Epoch酶标仪在570nm波长处测定各实验组样品吸光度(A)值。细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组A值/对照组A值)×100。重复实验3次。

SKOV3细胞接种96孔板，细胞贴壁生长 24h后，加入药物方法同前，应用Annexin V/PI 双染细胞经流式细胞术检测细胞凋亡。收集5×10⁵个细胞，加入500μL的Binding Buffer 悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC 混匀后，加入5μL 7-AAD染液，避光、室温孵育15min后，在流式细胞仪上检测。实验重复 3 次，结果以细胞凋亡率表示。细胞凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。

TRIzol法提取各组细胞总RNA，测量各组RNA浓度及A(260)/A(280)比值。逆转录合成cDNA，进一步进行PCR 反应扩增，引物序列设计如下：Bcl-2基因，上游引物为5′-TTGAGGAAGTGAACATTTCGGTG-3′，下游引物为5′-AGGTTCTGCGGACTTCGGTC-3′； Bax基因，上游引物为5′-CCTTTTGCTTCAGGGTTTCAT-3′，下游引物为5′-GAGACACTCGCTCAGCTCTTG-3′； 内参GAPDH基因，上游引物为5′-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3′，下游引物为5′-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3′。将PCR扩增产物加入1.2%琼脂糖凝胶，100V电泳20min，凝胶成像系统成像。观察 PCR 扩增产物的大小，结果以PCR电泳条带灰度值与GAPDH条带灰度值之比的半定量比值来表示。

采用 SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率、凋亡率和凋亡相关基因表达水平均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析法，两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

MLT、CBP单独及联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞在体外均有抑制细胞增殖的作用，且呈剂量依赖性。联合用药组SKOV3细胞增殖抑制率高于相同浓度CBP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。与双倍浓度CBP组比较，联合用药组SKOV3细胞增殖抑制率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

不同浓度的CBP和MLT作用于SKOV3 细胞，随着药物浓度的增加，SKOV3细胞的凋亡率增加。与同 浓度CBP组比较，联合用药组SKOV3细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。与双倍浓度CBP组比较，联合用药组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表 2和图 1。

A: 25.0 mg·L-1 CBP group;B: 2 mmol·L-1 MLT group;C: 25.0 mg·L-1 CBP +2 mmol·L-1 group MLT group.< 图 1 流式细胞术检测各组SKOV3细胞凋亡率 Fig.1 Apoptotic rates of SKOV3 in various groups detected by flow cytometry

图选项

与空白对照组比较，随着药物浓度的增加，不同浓度CBP 组和MLT组SKOV3细胞中 Bax基因表达水平升高(P<0.05)；与同浓度CBP组比较，联合用药组SKOV3细胞中Bax基因表达水平明显升高(P<0.05)。与空白对照组比较，随着药物浓度的增加，不同浓度CBP组和MLT组SKOV3中 Bcl-2基因表达水平降低(P<0.05)；与同浓度CBP组比较，联合用药组SKOV3细胞中Bcl-2基因表达水平明显降低(P<0.05)。见图 2和表 3。

a: CBP group;b: 1 mmol·L-1 MLT+CBP group;c: 2 mmol·L-1 MLT+CBP group;Lane 1: 12.5 mg·L-1 CBP group;Lane 2: 25.0 mg·L-1 CBP group;Lane 3: 50.0 mg·L-1 CBP group. 图 2 各组SKOV3细胞中Bax和Bcl-2基因表达电泳图 Fig.2 Electrophoregram of Bax and Bcl-2 expressions in SKOV3 cells in various groups

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MLT可与某些化疗药物协同抗肿瘤，作为辅助药物，具有一定的临床研究价值。杨旭然等^[9]研究显示：MLT与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合用药能明显增强5-FU的抑癌作用，抑制鼻咽癌细胞的增殖，降低不良反应发生，延长患者生存期并改善生活质量。另有研究^[10]显示：MLT联合全反式维甲酸可以抑制人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的增殖，促进其凋亡，联合用药的作用优于单用MLT组或全反式维甲酸组。孙晓东等^[11]体外研究发现：单独使用MLT和顺铂(DDP)都可以抑制肺癌A549细胞增殖，但MLT联合DDP使抑制作用更为明显。在食管癌的体外研究中，2.5mg·L^-1DDP与不同浓度MLT联合用药，对食管癌Eca109细胞生长抑制率明显高于单独使用DDP或MLT组，证实MLT可增强顺铂对人食管癌Eca109细胞增殖的抑制作用，诱导其凋亡^[12]。

Bax和Bcl-2是Bcl家族最具代表性的促进、抑制凋亡基因^{[13, 14]}。Bcl-2定位于线粒体、内质网以及核膜上，通过阻止线粒体细胞色素C的释放而实现抗凋亡作用。Bax主要位于细胞浆中，可自 身形成同源二聚体或者与Bcl-2相互作用形成异源二聚体，从细胞浆中转移到线粒体中，从而发挥其促进细胞凋亡的作用。在大多数肿瘤细胞中，Bcl-2表达水平增高，而Bax表达水平下降。通过下调Bcl-2或者上调Bax可以促进肿瘤细胞的凋亡，是肿瘤凋亡的机制之一^{[15, 16, 17]}。

本研究中MTT法和流式细胞术检测结果显示：MLT与CBP单独及联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞均具有抑制增殖及促进凋亡作用，联合用药组细胞增殖抑制率较单独应用CBP组增高，如与12.5mg·L^-1CBP联用，1和 2 mmol·L^-1MLT抑制率 高于单用CBP组；同样，联合用药组的细胞凋亡率较单独应用CBP组细胞凋亡率增高，如1和2 mmol·L^-1MLT与12.5mg·L^-1CBP联用，凋亡率高于单用CBP组(12.5mg·L^-1)的凋亡率。本研究结果表明：MLT与CBP联合应用比单用双倍剂量的CBP组对SKOV3细胞的增殖抑制及促凋亡作用强， 说明联合应用MLT可在减少CBP的用量同时，提高对卵巢癌SKOV3细胞的抑制增殖及促凋亡作用。本研究中RT-PCR检测结果表明：与单独应用CBP组比较，联合用药组SKOV3细胞中Bax 基因表达水平明显增高，Bcl-2基因表达水平明显降低，提示MLT诱导SKOV3细胞凋亡，与激活凋亡因子Bax的表达及抑制抗凋亡因子Bcl-2的表达有关，而其具体作用机制有待于进一步研究证实。本研究 结果表明：MLT对化疗药物CBP具有协同增敏作用，与单用CBP比较，不仅减少CBP的用量，同时能够在体外达到更好的抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡的作用，解决了铂类药物在临床上低应答的难题，减轻了应用铂类药物的不良反应。

综上所述，MLT作为化疗辅助药物，在一定程度上能抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡。体外研究表明：MLT可以促进卵巢癌SKOV3细胞的凋亡，抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。MLT与CBP联合应用时，对卵巢癌的增殖抑制及促进凋亡作用优于单独应用CBP，并且在减少CBP用量的同时，达到更好的增殖抑制及促进凋亡的效果。本研究结果为卵巢癌联合化疗的临床应用提供了实验依据。