麦芽糖酶和葡萄糖化酶(maltase-glucoamylase,MGAM)复合体、蔗糖酶和异麦芽糖酶(sucrase-isomaltase,SI) 复合体均属于α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，人体当中的这4种α-葡萄糖苷酶均具有水解α-1,4糖苷键的作用，其中SI 复合体的N端还具有水解α-1,6糖苷键的作用，SI 复合体在肠道中的胰蛋白酶的作用下分解为蔗糖酶和异麦芽糖酶(isomaltase,ISO)而发挥作用^{[1, 2]}。 随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率逐年上升，预计2030年全球患病人数将达到5.52亿^[3]。多项调查研究^{[4, 5, 6]}表明：如果血糖不能有效控制，将对血管、神经等多个系统造成损害，产生多种并发症。碳水化合物必需经过α-葡萄糖苷酶水解生成单糖之后才能被小肠吸收，因此抑制α-葡萄糖苷酶的活性，对于降低餐后血糖有重要意义。目前，化学合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖、伏格列波糖等药物在临床上应用广泛，但制备工艺复杂且都存在一定的不良反应^[7]，许多天然α-葡萄糖苷酶抑制剂也有大量研究^{[8, 9]}，但材料来源相对有限。 本研究在体外获得双糖水解酶人异麦芽糖酶(hISO)基因，构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO，通过在大肠杆菌中表达得到hISO蛋白，为今后以其为抗原，采用免疫手段得到抗体，通过抑制hISO活性而控制餐后血糖奠定实验基础。

Caco-2细胞、pET-28a(+)表达载体、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和DH5α由本实验室保存。Trizol 试剂(美国Invitrogen 公司)，高保真Taq DNA聚合酶和DNA胶回收试剂盒(上海生工)，T4DNA连接酶、DNA marker、PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2、限制性核酸内切酶NheⅠ和NotⅠ(日本Takara公司)，蛋白质相对分子质量标准(美国Thermo公司)，Ni-NAT预装柱( 英国GE公司)，Anti-SI抗体(ab84977，英国Abcam公司)。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

根据GenBank 公布的序列(NCBI Reference Sequence: NM_001041.3)为参考，设计ISO基因的特异性PCR引物，引物设计如下：上游引物5′- CTAGCTAGC ACACCCAATCGTTTCCGGTTCAAG-3′ (下划线部分 为NheⅠ酶切位点)，下游引物5′- TATGCGGC CGC AGGAGTAATAAGTAATGCAGGGCCCCA -3′ (下划线部分为NotⅠ酶切位点)。

复苏冻存的Caco-2细胞，用含10％胎牛血清的DMEM，37℃、5% CO₂条件下培养，待细胞铺满瓶80%时用胰蛋白酶消化收集细胞，用Trizol 试剂提取总RNA，具体方法参照说明书进行，提取后的总RNA经琼脂糖凝胶电泳并拍照，若电泳结果显示28S、18S和5S条带清晰完整，说明总RNA较完整，无拖尾和降解现象，符合后续实验要求。

Caco-2类似小肠上皮细胞模型^[10]，以Caco-2细胞总RNA为模版，按照逆转录试剂盒说明书操作进行，以一步RT-PCR扩增目的基因。PCR反应体系为：模版RNA 1μL,PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL，2×1 Step Buffer 25μL，上游和下游引物各2μL，补充RNase Free dH₂O至50μL。扩增条件：50℃、30min；94℃、2 min，94℃、30s，60℃、30s，72℃、2min，25个循环；72℃延伸6min。扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳并拍照，理论上应获得大小为1770bp左右的ISO基因片段。

参照文献[11]进行并略作改动。将pET-28a(+)表达载体的质粒和电泳后回收的扩增产物分别用NheⅠ和NotⅠ双酶切，在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接18 h，将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布于含有卡那霉素的平板上进行抗性筛选，过夜培养后平板上可见单菌落，挑取多个阳性克隆提取质粒进行PCR扩增及NheⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，由于ISO基因大小为1770bp，pET-28a(+)片段为5304bp，故经NheⅠ和NotⅠ双酶切应产生2个条带，若使用单酶切后得到大小为7074bp片段。酶切鉴定正确的重组质粒送上海立菲生物技术有限公司测序，将测序后的结果与GenBank中已公布的序列通过Vector NTI软件进行比对，序列完全正确的重组质粒命名为pET-28a(+) -hISO。

将测序鉴定正确的重组质粒pET-28a(+)-hISO转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取卡那霉素平板上生长的单菌落37℃摇床上振荡培养，至对数生长期A₆₀₀为 0.5~0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol·L^-1，分别在0、2、3、4和5h不同时间下诱导表达后收集菌体，PBS洗涤后，加入Tris-NaCl缓冲液超声破碎裂解菌体，收集上清，进行SDS-PAGE电泳，检测分析hISO融合蛋白(相对分子质量68860)的诱导表达情况。

融合蛋白纯化采用Ni-NAT柱亲和层析，参照说明书进行，用分别含10、20、40、60、80、100和200 mmol·L^-1咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，流速为2mL·min^-1，收集各阶段洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳检测ISO融合蛋白相对分子质量和纯度。

纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE电泳后，半干法转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜后加入SI抗体(ab84977)，4℃过夜，TBST洗涤3次，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显色并拍照，若显色后条带单一且大小为69 000左右，说明纯化的蛋白是ISO融合蛋白，并且没有降解。

提取的Caco-2细胞的总RNA见图 1，无拖尾和降解现象，28S、18S和5S条带完整清晰，经紫外分光光度计检测纯度符合要求，可以用于模板扩增目的片段。

Lane 1,3: Total RNA of Caco-2 cells;Lane 2:DL10000 DNA marker. 图 1 Caco-2细胞的总RNA琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 Agarose gel electrophoregram of total RNA from Caco-2 cells

图选项

以所提取的Caco-2细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为1770bp片段，与预期大小相一致。见图 2。

Lane 1: hISO;Lane 2: DL10 000 DNA marker. 图 2 hISO 基因RT-PCR 产物 Fig.2 RT-PCR products of hISO gene

图选项

将在抗性平板上生长的单菌落随机挑取多个进行摇菌培养，提取重组质粒进行PCR扩增目的基因，均有目的条带。将质粒DNA用NheⅠ和NotⅠ双酶切，得到目的片段(大小1 770bp)和酶切后的pET-28a(+)(大小5 304bp)，使用单酶切后得到大小为7 074bp片段，见图 3。将测序后的结果与GenBank中已公布的序列进行比对，部分测序及比对结果见图 4和5，证明载体pET-28a(+) -hISO构建成功。

Lane 1: Plasmid digested by double-enzyme;Lane 2: DL10000 DNA marker;Lane 3: Plasmid digested by single -enzyme. 图 3 pET-28a(+)-hISO 的酶切鉴定 Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-28a(+)-hISO by enzyme digestion

图选项

图 4 pET-28a(+)-hISO 的部分测序结果 Fig.4 DNA partial sequencing of pET-28a(+)-hISO

图选项

图 5 pET-28a(+)-hISO重组载体插入片段部分比对图 Fig.5 Part of sequencing figure of inserted fragment of pET-28a(+)-hISO

图选项

在0、2、3、 4和5h不同的诱导时间下IPTG诱导蛋白的表达，与蛋白质相对分子质量标准进行比对， pET-28a(+)-hISO经诱导后产生相对分子质量约为69000的蛋白，与预期hISO蛋白大小 (68860)相一致。经SDS-PAGE电泳检测分析诱导表达情况，随着诱导时间增加，所获得的融合蛋白的表达水平逐渐升高，在诱导4 h后得到的蛋白表达水平最高。见图 6。

Lane 1-5: Total protein of recombinant strains at 0,2,3,4 and 5 h after induction;M: Protein marker. 图 6 ISO融合蛋白SDS-PAGE电泳图 Fig.6 SDS-PAGE electrophoregram of ISO fusion protein

图选项

将裂解后的上清经Ni-NAT柱亲和层析纯化，结果见图 7。在不同咪唑浓度下的洗脱峰，纯化后的融合蛋白在相对分子质量69 000附近条带较单一且清晰，在清洗液中无目的蛋白，说明融合蛋白与Ni柱完全吸附。经10、20、40、60、80、100和200 mmol·L^-1咪唑缓冲液进行阶段洗脱，随着咪唑缓冲液浓度的增加，洗脱后得到的蛋白浓度也逐渐增加，在40和60 mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白，在100、200 mmol·L^-1咪唑缓冲液下未见目的条带，说明蛋白完全洗脱。

Lane 1:Washing fluid;Lane 2-8:Elution buffer containing 10,20,40,60,80,100 and 200 mmol·L-1 imidazole;M:Protein marker. 图 7 融合蛋白纯化的SDS-PAGE分析 Fig.7 SDS-PAGE analysis of purification of fusion protein

图选项

亲和层析纯化的hISO重组蛋白，经SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，ECL发光显色后，在69 000处出现单一的目的条带(预期大小为68 860)，表明重组的融合蛋白能够与抗SI抗体发生特异性结合反应，获得了ISO融合蛋白。见图 8。

Lane 1-7:hISO fusion protein. 图 8 Western blotting法检测hISO蛋白 Fig.8 hISO protein detected by Western blotting method

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α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前治疗糖尿病的口服降糖药物中一类，因其研究相对比较成熟，所以在临床上使用广泛，其可以竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使摄入的淀粉类物质水解成为单糖的速度减慢，从而延缓单糖吸收达到降低餐后血糖的目的。

本研究采用RT-PCR法以Caco-2细胞的总RNA为模板，扩增得到hISO部分基因序列，将其克隆到pET-28a(+)原核表达载体中，体外表达获得融合蛋白hISO。由于pET系统表达重组蛋白功能强大，同时宿主大肠杆菌生长迅速，培养成本相对低廉，可以大量培养，pET-28a(+)中含有T7强启动子^[12]，因此目的基因可以高水平转录，含有的6×His标签使其可以采用Ni-NAT柱亲和层析纯化融合蛋白。在纯化融合蛋白过程中，由于有文献报道BL21(DE3)的融合蛋白多以包涵体的形式存在，需要使用尿素等变性剂将其溶解并进行复性处理，操作繁琐且蛋白质活性容易受到影响^{[13, 14]}。本研究直接用超声裂解处理的菌体离心上清中纯化得到可溶性蛋白，而并未处理沉淀中的包涵体，这种方式相对简单，且获得的融合蛋白足够满足后续实验的需要。

在后续实验中要使用融合蛋白作为免疫原免疫产蛋鸡获得卵黄抗体。有研究^[15]表明：带有标签的融合蛋白在后续实验中进行抗体制备时并不受His标签蛋白影响。本研究通过克隆hISO的部分序列，体外表达融合蛋白，并准备以其为抗原制备卵黄抗体用于降低餐后血糖，该实验为进一步探索在2型糖尿病治疗中针对α-葡萄糖苷酶靶向抑制作用的研究奠定了基础。